EGFR 20号外显子插入突变（EGFRins20）约占EGFR激活突变的10%左右，EGFRins20突变对EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）并未表现出与EGFR 19外显子缺失突变（19del）和21外显子L858R（21 L858R）等经典EGFR突变相似的敏感性。EGFRins20突变患者的治疗极具挑战性，但近年来，EGFRins20突变患者在治疗方面也取得了显著进展。本篇综述就EGFRins20突变的分子和临床病理特征，以及最新治疗进展进行详细阐述。
背 景
在非小细胞肺癌（NSCLC）中，EGFR突变的发现极大地改变了该类患者的治疗格局。相比于传统化疗，第一代EGFR TKI（吉非替尼和厄洛替尼）治疗显著改善了上述患者的临床预后。随着二代（阿法替尼和达可替尼等）、三代EGFR TKI（奥希替尼等）的发展，进一步将EGFR突变晚期NSCLC患者的中位总生存期（OS）延长到3年以上。在精准治疗时代，随着检测技术的提升，越来越多EGFR突变类型被识别，包括EGFR20外显子的插入突变以及G719X、S768I和L861Q等点突变，如图1所示。
图1 EGFRins20的发生频率
EGFRins20是EGFR突变的第三大常见亚型，在EGFR突变患者中发生率约为10%。虽然存在一定异质性，总体而言，EGFRins20突变对EGFR TKI并不敏感。近年来，针对上述患者开展的靶向治疗取得了重大进展，本文中会就最新研究进展进行详细探讨。
EGFRins20 NSCLC临床和流行病学特征
当与经典EGFR突变分开考虑时，EGFRins20约占所有NSCLC的1%~2%，其发生频率与RET和ROS1重排相似。EGFRins20多见于不吸烟、女性、亚裔NSCLC患者。由于EGFRins20与HER 2突变非常相似，其治疗模式也会参考抗HER2治疗。
EGFRins20 NSCLC分子生物学特征
EGFR 20外显子由762~823位氨基酸组成，包含两个重要区域：762~766位氨基酸组成的调节性C螺旋结构以及紧邻的767~774位氨基酸形成的环。EGFRins20主要是在761~775位氨基酸发生3~21个碱基的插入或复制突变，通过将C螺旋结构推向内部，诱导受体活性构象，从而以不依赖配体的方式激活受体（图2）。截至目前为止，已经发现超过60种EGFRins20激活突变，大多数是紧邻C螺旋结构的环出现1~4个氨基酸插入。与EGFR 19del和HER 20ins（最常见的是A775_G776insYVMA）相比，EGFRins20具有显著异质性。
图2 EGFRins20位置
体外实验显示，EGFRins20突变体催化活性中等，强于野生型EGFR，但弱于EGFRL858R突变体。早期的晶体结构研究显示，EGFR19del和L858R直接影响ATP结合口袋的结构，相比于野生型EGFR，对ATP的亲和力增加，这允许TKI有较大的治疗窗口，而EGFRins20却不同于19del和L858R。比较EGFRins20 D770insNPG和EGFR T790M以及野生型EGFR的3D模型发现，EGFRins20与EGFR T790M结构类似，解释了一代、非共价TKI耐药的原因。这些研究也表明C螺旋结构以及磷酸盐结合环结构向药物结合口袋的移动导致某种程度的空间位阻，从而抑制TKI的结合。
这些结构上的差异解释了开发针对EGFRins20小分子抑制剂面临的核心挑战，也进一步揭示了EGFRins20对一代和二代TKI不敏感的原因。但是，EGFRins20 A763_Y764insFQEA是一个特例，它对一代TKI的亲和力比其他EGFRins20要高10倍。此外，一些罕见病例也报道到阿法替尼对于H773dup、H773_V774insNPH和N771delinsKG突变相对敏感，但尚未从结构方面进行解释。
尽管EGFRins20研究已经取得了一定进展，但EGFRins20突变的复杂性限制了系统研究每种突变的结构特征以及对EGFR TKI的敏感性。V769-D770 insX、D770-N771 insX和H773-V774 insX相比于其他插入突变较为常见，但从临床角度考虑，这些都属于罕见突变，这也为发现共有的可靶向结构特征带来了困难。
从临床角度来看，一个同样重要的挑战是实现对患者EGFRins20的可靠识别。在美国各地和国际上使用的临床基因分型分析的广泛差异性会导致一部分患者漏诊。例如，最初用于EGFR基因分型的较老、基于突变特异性PCR的检测方法往往不能捕捉到第20外显子的基因改变。随着二代测序（NGS）平台的出现，使得NSCLC患者中EGFRins20的更有效和全面识别成为可能。通过液体活检的方法检测循环肿瘤DNA（ctDNA）也可以检测到EGFR 20外显子基因改变，但这种检测方法的敏感性会受到肿瘤DNA流入血液程度的限制。总体而言，上述诊断方面的改进促进了更多的临床试验登记，并为新疗法的开发创造了动力。
EGFR ins20靶向治疗
尽管靶向EGFR ins20的治疗相对棘手，过去5~10年，仍有一些临床试验开展，并且取得了一定临床疗效，具体如图3所示。
图3 EGFR ins20靶向治疗研究进展
酪氨酸激酶抑制剂（TKI）
Poziotinib（波齐替尼）
Poziotinib（HM781-36B）可以与EGFR和HER2共价结合，并且能够抑制携带EGFR经典突变、T790M突变以及HER 2高表达NSCLC细胞株生长。其结构与二代TKI 阿法替尼类似，体外研究显示，波齐替尼对于最常见的EGFRins20以及HER2ins20突变的Ba/F3细胞具有显著增殖抑制作用，分别可以达到奥希替尼和阿法替尼的100倍和40倍。此外，波齐替尼对于EGFRins20的敏感性比对EGFR T790M要高65倍，而对于野生型EGFR抑制活性相当，这也暗示波齐替尼治疗窗口相对较窄。3D模型显示，EGFRins20突变导致药物结合口袋的改变影响了大多数三代TKI的结合，但波齐替尼由于具有分子结构小、灵活性强的特点，可以更好地与EGFRins20结合。相比于阿法替尼，波齐替尼对EGFR ins20 D770insNPG的结合自由能更低。
基于上述体外研究结果，陆续开展了在基因工程鼠和PDX模型的相关研究，以及确定Ⅱ期推荐治疗剂量（RP2D）的Ⅰ期研究和一项单中心、Ⅱ期临床试验（入组患者为经治EGFR或HER 2第20外显子插入突变NSCLC患者）。在40例可评估EGFRins20患者中，8周未经证实的客观缓解率（ORR）为58%（23/40），结果令人欣喜。既往接受过TKI治疗患者的ORR为62%（8/13）。最常见的治疗相关不良事件是皮疹和腹泻，60%患者经历了3级毒性，45%需要减量治疗。在HER 2队列（n=13）中，ORR为50%，毒性反应发生情况相似，有1例患者发生5级肺炎。
在上述研究基础上，随后开展了一项多中心、Ⅱ期ZENITH20临床研究，遗憾的是，该研究结果显示，波齐替尼对EGFRins20临床抗肿瘤活性相对有限。在115例中位治疗线数为2的EGFRins20患者中，ORR为15%，中位无进展生存期（PFS）为4.2个月。皮肤和胃肠道毒性的发生率很高，65%的患者需要减量治疗。上述结果的发表，在一定程度上也限制了阿法替尼和达可替尼的临床应用。
综上所述，波齐替尼是一种结构独特、不可逆的EGFR TKI，对EGFRins20 NSCLC具有中等活性，但其临床活性被显著副作用所减弱。波齐替尼（16 mg，每日给药）对EGFRins20 NSCLC的活性比预期要差，特别是考虑到正在研发的其他竞争药物。目前而言，ZENITH20临床试验正在探索新的替代给药策略，诸如8 mg，每日2次，期待后续结果公布。
Mobocertinib （TAK-788）
Mobocertinib（TAK-788或AP32788）是另一个可以共价结合于EGFR和HER 2 C797位半胱氨酸氨基的TKI。Ba/F3细胞模型研究显示，相比于其他TKI，Mobocertinib对EGFR ins20的抑制选择性高于野生型EGFR。MobocertinibⅠ/Ⅱ期多中心研究（NCT02716116）的初步临床数据显示，该研究共入组28例既往接受过治疗并且携带EGFRins20的晚期NSCLC患者，RP2D为160 mg，每日一次，ORR为43%，中位PFS为7.3个月。最近，在96例纳入Ⅱ期研究队列经治患者中，独立盲审委员会和研究者评估ORR分别为23%和32%，中位PFS为7.3个月。与波齐替尼类似，最常见的不良事件是胃肠道反应，92%接受160 mg治疗的患者发生任意级别腹泻（16%≥3级），恶心和皮疹发生率分别为28%和45%。与治疗相关的不良事件导致21%患者减量治疗，10%患者停止治疗。
基于上述研究初步结果，FDA批准了Mobocertinib孤儿药称号（2019年），随后又获得了突破性治疗称号（2020年4月）。目前正在进行的Ⅲ期EXCLAIM-2研究正在进一步评估Mobocertinib与含铂双药化疗对于初治患者的临床疗效（NCT04129502），这是目前第一个前瞻性评估EGFRins20靶向治疗与当前一线标准治疗相比的临床研究，期待后续结果公布。
奥希替尼
奥希替尼是第一个获批的三代TKI，对del19、L858R、T790M和G719等激活突变均敏感，奥希替尼目前获批适应症为19del和21L858R突变晚期NSCLC一线治疗和早期NSCLC辅助治疗，以及一代、二代TKI治疗失败合并T790M突变NSCLC二线治疗。尽管最先的研究认为奥希替尼对EGFRins20（H773-V774HVdup）无效，但之后研究发现，奥希替尼与阿法替尼一样，对一代TKI耐药的EGFRA763_Y764insFQEA以及其他EGFRins20突变体（Y764_V765insHH、A767_V769dupASV和D770_N771insNPG）有效。然而，相比于EGFRins20，奥希替尼对野生型EGFR IC50值高10倍，但相比于19del、L858R和T790M，IC50值要高出10~100倍，这意味着要达到相当的临床效果必须提高剂量。
基于上述数据，奥希替尼对于EGFRins20 NSCLC疗效的研究也在开展中。第一份关于奥希替尼对于EGFRins20 NSCLC的临床反应的报告涉及一名80岁、从不吸烟的女性患者，是携带EGFR20S768_D770dup的转移性肺癌。在对有症状性脑转移进行全脑放疗后，患者选择超说明书高剂量（每日160 mg剂量）奥希替尼治疗，颅外部分缓解（PR）持续11个月。同样，中国学者报告了6例接受奥希替尼80 mg每日治疗的携带EGFRins20 NSCLC患者，其中4例PR。ECOG-ACRIN EA5162是一项前瞻性、Ⅱ期临床研究，旨在评估奥希替尼160 mg每日治疗对于经治EGFRins20 NSCLC的临床疗效。
尽管尚未达到主要研究终点，ECOG-ACRINEA5162初步结果显示，在前17例可评估患者中，有3例证实PR，1例未证实缓解，1例完全缓解（CR）。ORR为24%（4/17），中位PFS为9.6个月。与每日80 mg治疗剂量相比，160 mg奥希替尼治疗腹泻（76%）、乏力（67%）和痤疮样皮疹（38%）发生率更高，但未观察到3级胃肠道或皮肤毒性反应。基于上述结果，研究者计划扩大EA51621研究，进一步研究奥希替尼160 mg在更大样本EGFRins20 NSCLC队列中的作用。
目前而言，尚无临床研究评估奥希替尼80 mg和160 mg治疗剂量对于EGFRins20 NSCLC患者的临床疗效。但是，160 mg治疗剂量在目前临床研究被广泛采用，主要是基于以下两点原因：首先，临床前数据表明，与经典突变相比，抑制EGFRins20需要更高的IC50值。第二，奥希替尼被证实160 mg每日治疗量对于中枢神经系统（CNS）疾病患者是安全有效的，这些患者需要更高的药物浓度以达到足够的临床疗效。
CLN-081 （TAS6417）
TAS6417是由日本Taiho Pharmaceutical开发的新型EGFR TKI，共价结合于C797残基，选择性抑制EGFRins20。目前正在开展Ⅰ/Ⅱa期临床试验。来自前17例EGFRins20患者的早期数据显示，未证实的ORR为35%，疾病控制率为100%。
BDTX-189
BDTX-189是另外一个不可逆、选择性抑制ERBB非经典突变的TKI，临床前研究显示，BDTX-189对于EGFR和HER2 ins20突变以及胞外结构域突变均有抑制作用，目前正在开展Ⅰ期临床试验。
单克隆抗体
Amivantamab （JNJ-372）
Amivantamab （JNJ-372）是一种EGFR/c-Met双抗，前期研究显示，amivantamab对于携带不同EGFR突变晚期NSCLC显示出显著抗肿瘤疗效和安全性，也促使amivantamab对于EGFR ins20 NSCLC临床疗效的进一步研究。Amivantamab在疗效方面要优于其他EGFR单抗，具体作用机制有待于进一步研究证实。专家预测这可能是由于amivantamab结合EGFR和MET的过程产生协同抑制作用，因为相互连接的下游信号通路同时受到影响。这一假设得到了临床前研究的支持，在多种EGFR和MET驱动的NSCLC中，amivantamab的抑制作用比EGFR单抗和MET单抗联用要强。
一些研究还表明，双特异性抗体提高了对受体过表达细胞的选择性，因为它们需要同时结合两个独立的抗原表位。值得注意的是，在考虑抗体的治疗机制时，生物学背景（biological context）尤其重要，配体依赖程度、细胞表面上受体密度的细微差异以及其他因素都会影响抗体治疗效果。
CHRYSALIS Ⅰ期临床研究结果最新公布，进一步证实了amivantamab的临床疗效（表1）。结果显示，接受amivantamab治疗的81例EGFR ins20 NSCLC患者RP2D为1050 mg（1400 mg，≥80 kg），ORR为40%，中位PFS为8.3个月。86%患者出现皮疹，只有4%为3级皮疹。其他常见的治疗相关不良事件是输注相关反应（66%，只有3%≥3级，主要是第一次输注）和副甲炎（42%），但总体治疗相关的3级事件只有16%。Amivantamab于2020年3月成为第一个获得FDA突破性治疗指定的EGFR20ins靶向治疗，并第一个于2021年5月获得FDA批准。
抗体-TKI联合用药
尽管TKI和EGFR靶向抗体单药治疗相关临床研究在EGFRins20 NSCLC患者中广泛开展，二者联合用药仍然是有潜力的。特别是EGFR单抗，一直以来单药治疗EGFR TKI敏感的EGFR-突变NSCLC模型中不尽人意，而且对EGFRins20疗效也差强人意。目前正在研究的抗体-TKI联合包括西妥昔单抗、necitumumab和amivantamab与多种第二代和第三代EGFR TKI的联合，期待后续研究结果的公布。
其他治疗
Luminespib （AUY922）
AUY922是一种HSP90抑制剂，而EGFR需要分子伴侣HSP90来稳定蛋白质到构象成熟。临床前研究显示，HSP90可以抑制EGFRins20突变细胞的下游信号以及诱导细胞凋亡。目前正在开展Ⅱ期临床，结果显示，本研究共纳入29例至少接受过一次治疗的NSCLC患者，ORR为17%，中位PFS为2.8个月，中位OS为9.9个月。6例患者（21%）由于治疗毒性需要减量治疗，其中最显著的与治疗相关的不良反应是腹泻、眼部毒性、乏力和高血压。遗憾的是，这种化合物已不再在临床上开发。
Tarloxotinib
Tarloxotinib是一种低氧激活的pan-HER激酶抑制剂，对广泛的HER家族癌基因有抑制活性。但一项正在进行的Ⅱ期研究显示其对EGFRins20患者无效。然而，在HER2ins20和HER2、NRG1和其他融合的NSCLC中有效，有关临床试验尚在进行中。
总 结
由于EGFRins20突变肿瘤对已上市的EGFR TKI缺乏敏感性，导致该EGFR突变肿瘤亚群被认为是不可靶向或固有耐药的。此外，EGFRins20突变的多样性以及由此导致的常规临床基因分型测试的难度使得其频率被低估。以往EGFR ins20 NSCLC的诊断意味着靶向治疗无效，然而，最近在靶向EGFRins20突变药物研发方面取得的进展以及临床上对该类突变更有效的检测，使得在未来像EGFR19del和L858R等经典突变一样的精准治疗成为现实。精准治疗，检测先行，期待未来能够在精准检测的指导下，实现患者的个体户、精准化治疗。
Meador CB, Sequist LV, Piotrowska Z. Targeting EGFR Exon 20 Insertions in Non-Small Cell Lung Cancer:Recent Advances and Clinical Updates. Cancer Discov. 2021 Sep;11(9):2145-2157. doi: 10.1158/2159-8290.CD-21-0226.
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