1.我国非小细胞肺癌分子变异谱包括哪些？
答：我国 NSCLC患者分子变异谱不同于西方人群，主要体现在腺癌，包括常见变异基因表皮生长因子受体（EGFR，45%~55%）、KRAS（8%~10%）、间变性淋巴瘤激酶（ALK）（5%~10%），少 见 变 异 基 因 ROS1（2%~3%）、MET（2%~4%）、HER2（2%~4%）、BRAF（1%~2%）、RET（1%~4%），以及罕见变异基因NTRK（<1%）、NRG1/2 （<1%）、FGFR2（<1%）等。除极少数病例存在共突变外，上述基因变异在同一个病例中普遍存在互斥现象
免疫治疗相关分子病理检测包括PD‑L1蛋白表达和TMB。其他生物标志物，如高度微卫星不稳定（MSI‑H）在 NSCLC 中罕见。目前免疫治疗主要用于 EGFR、ALK 和 ROS1 基因变异阴性的 NSCLC患者
靶向治疗相关分子病理检测详见表 1
2.哪些患者适合做分子病理检测？
答：1.拟接受靶向治疗的肺浸润性腺癌（或包括含腺癌成分的 NSCLC）患者需进行靶分子基因检测。对于晚期 NSCLC 患者，靶分子基因检测能够有效筛选靶向药物获益人群。对于术后肺腺癌患者，一方面，EGFR 基因突变阳性患者可从酪氨酸激酶抑制剂（TKI）辅助治疗中获益；另一方面，术后患者存在复发风险，分子分型可直接指导复发后肿瘤治疗方案的选择
2. 经活检组织病理学证实为非腺癌的晚期NSCLC 患者可推荐进行靶分子基因检测。除肺腺癌外，靶分子基因变异在其他 NSCLC患者（如肺腺鳞癌、非特指NSCLC、大细胞肺癌及肺肉瘤样癌等）中真实存在，且患者可在靶向药物治疗中获益。如EGFR 基因敏感突变、EML4‑ALK 基因融合可发生于非腺癌的晚期 NSCLC；MET 变异在肉瘤样癌中发生率高；此外，部分由活检证实为鳞状细胞癌的患者，经术后病理证实存在肺腺癌成分
因此经活检组织病理学证实为非腺癌的晚期 NSCLC患者均可推荐进行靶分子基因检测，以期使这部分患者获得更多治疗方案的选择
３. 所有 EGFR、ALK 基因变异阴性晚期 NSCLC患者，如拟进行 PD‑1/PD‑L1抗体药物免疫治疗，推荐 进 行 PD‑L1 表 达 检 测
3.应该采用哪种方案进行检测？
答：针对上述 NSCLC 中基因变异检测，常见的分子病理检测方法包括Sanger测序、FISH、qRT‑PCR、IHC、二代测序技术等（表 2）
4.哪些标本可以送检？
答：1.检测标本优先使用肿瘤组织石蜡标本：主要包括手术、纤维支气管镜下活检、CT 引导下肺穿刺、胸腔镜、淋巴结穿刺活检等方法获取的标本检测前需对肿瘤细胞比例进行评估，满足检测要求后方可进行检测。对于手术标本，优先选取肿瘤细胞比例较高的标本进行基因检测。若肿瘤细胞比例较低，可通过富集，以保证检测结果的准确可靠。
2. 细胞学标本：包括胸腔积液、经皮肺穿刺活检、支气管内超声引导细针穿刺活检（EBUS FNA）、痰、肺泡灌洗液等，需制作成石蜡包埋标本，进行肿瘤细胞比例评估，满足检测要求后可进行检测。
3.对于少数客观上不能获得组织或细胞学标本的晚期肺癌患者，推荐血液检测。晚期 NSCLC患者的血液中存在循环游离肿瘤DNA（ctDNA），其血浆中 ctDNA 有更高的检出率。可用含有游离DNA 保护剂及防细胞裂解保护剂的专用常温采血管或用常规 EDTA 抗凝管（严禁使用肝素抗凝管）采集全血并进一步分离血浆。对于部分晚期发生脑膜转移的 NSCLC 患者，脑脊液对颅内肿瘤的ctDNA具有富集作用，可通过腰椎穿刺获取脑脊液进行相关基因检测。与肿瘤组织相比，血液和脑脊液中的ctDNA含量很低，其基因检测具有较高的特异度，但灵敏度较差。
5.EGFR基因检测临床实践常见问题及解决策略有哪些？
答：EGFR基因变异类型：EGFR基因变异包括基因突变（点突变、插入/缺失突变），主要发生在编码EGFR 酪氨酸激酶区的第 18~21 号外显子，以及获得性耐药突变（包括第一、二代 TKI 的耐药突变T790M 和 第 三 代 TKI 的 耐 药 突 变 C797S 等）。EGFR 基因扩增对选择 TKI 治疗目前无明确临床意义
（1）常见突变位点：目前中国已上市的qRT‑PCR体外诊断试剂盒主要包括EGFR第18~21号外显子常见突变类型（20~40多种）。
（2）罕见突变位点：随着二代测序检测普遍应用于临床检测，越来越多的罕见突变位点被发现，尤其是外显子 19 插入突变和外显子20插入突变，约占全部EGFR突变的5%。其中约一半以上EGFR罕见突变对TKI靶向药物治疗敏感，EGFR 基因罕见位点的检测也有助于正在研发中药物的临床试验入组。因此，对于传统方法检测的驱动基因阴性晚期肺腺癌患者，推荐进行二代测序检测。
（3）耐药机制检测：目前 EGFR TKI 的耐药机制已经基本明确，大部分是由 EGFR T790M的获得性突变，约占 50%。其他机制包括 MET 基因扩增、KRAS 突变、BRAF 突变等。因此，对于第一、二代EGFR‑TKI耐药患者，优先推荐进行T790M检测（qRT‑PCR 或二代测序）。也可同时与其他耐药机制进行检测或 T790M 检测阴性后用高通量技术（二代测序）进行其他耐药机制的检测。第三代TKI 耐药患者，推荐进行二代测序检测耐药机制。另外，组织学形态的转化（如小细胞癌、鳞癌）也是TKI耐药机制之一
6.ALK 基因检测临床实践常见问题及解决策略有哪些？
答：ALK基因变异类型：ALK基因变异类型包括基因重排/融合，以及获得性耐药突变（点突变为主）。目前至少发现了 20 多种 EML4‑ALK 融合变异亚型。此外还有更多少见/罕见的ALK融合伴侣不断被发现［40］。上述 ALK 基因重排均可导致融合基因/蛋白的表达，提示适用于抗 ALK 抑制剂靶向治疗
ALK 激酶区的获得性突变是 ALK 抑制剂治疗耐药的主要机制之一，对指导耐药患者的后续临床治疗具有一定的指导意义
在进行IHC‑Ventana D5F3、FISH、qRT‑PCR及二代测序检测结果判读时，对于检测结果不能确定、信号不典型或者位于临界值的患者，应建议使用其他 技 术 平 台 进 行 检 测 。优 先 应 用 IHC‑VentanaD5F3进行ALK检测。当怀疑检测标本有质量问题时，优先应用FISH检测。当和其他基因（如EGFR、ROS1等）一起检测时，可以进行qRT‑PCR或二代测序检测
7.ROS1基因检测临床实践常见问题及解决策略有哪些？
答：ROS1 基因变异类型：ROS1 基因变异包括ROS1 基因重排。目前共发现十余种 ROS1 基因融合伴侣，主要包括 CD74、SLC34A2、CCDC6、TPM3、EZR 等，其断裂位点主要位于 ROS1 基因的第 32~36号外显子
IHC检测ROS1蛋白表达用于初筛ROS1融合临床应用前，实验室应经过严格的检测流程、判读标准、质量控制和保证，阳性病例需经过其他技术平台进行验证。在进行 FISH、qRT‑PCR 及二代测序检测结果判读时，对于检测结果不能确定、信号不典型或者位于临界值的患者，应建议使用其他技术平台进行检测。当和其他基因（如 EGFR、ALK 等）一起检测时，可以进行qRT‑PCR或二代测序检测
8.PD‑L1表达检测临床实践常见问题及解决策略有哪些？
答：通过 IHC 检测肿瘤细胞和/或免疫细胞 PD‑L1 的表达水平是目前判断 NSCLC患者能否从免疫检查点抑制剂治疗中得到更多获益的主要评估手段
经 3.7% 中性甲醛固定石蜡包埋的肿瘤组织样本是检测 PD‑L1 表达标准的标本类型。
手术切除标本和活检标本均可进行 PD‑L1 检测。由于肿瘤具有异质性，PD‑L1表达在瘤内和瘤间存在一定的异质性。
采用活检标本进行 PD‑L1 应保证足够的标本量。
目前，仅组织学标本被批准用于PD‑L1检 测，细胞学标本尚未经过临床验证，实验室需做好充分的方法验证和质量控制；在组织学标本不可获得 的 情 况 下 ，可 尝 试 用 细 胞 学 蜡 块 标 本 进 行PD‑L1 检测，但在报告中应予以必要的说明，仅供临床参考。
应合理安排驱动基因检测和 PD‑L1 检 测，建议同时检测，当标本有限时，尤其是肺腺癌患者 ，应 优 先 考 虑 驱 动 基 因 检 测（EGFR、ALK、ROS1等）
9.MET 基因检测临床实践常见问题及解决策略有哪些？
答：目前国外已有 MET 抑制剂获批用于含 MET 第 14 号外显子跳跃突变 NSCLC 患者的靶向治疗，国内亦有赛沃替尼（Savolitinib）已进入优先审批。
在临床实践中，MET基因第14号外显子跳跃突变的检测，可与其他驱动基因变异同时检测，或对其他驱动基因变异阴性的患者进行单独检测。应根据可及的检测平台、标本质量及标本类型，合理选择不同的检测方法。可参考其他融合基因检测策略。当组织标本不可及时，血浆标本也可以考虑用于 MET 第 14 号外显子跳跃突变的检测，作为补充
MET 扩增的检测尤其在 EGFR‑TKI 耐药人群中，如有充足的肿瘤组织标本，可以考虑优先选择二代测序。对于检测结果不能确定、有扩增信号但不典型或者位于临界值的患者，应建议使用 FISH进行复测。对于特殊患者人群，如 EGFR‑TKI 耐药后T790M及其他耐药机制阴性人群，或者组织标本肿瘤细胞含量较低时，考虑到二代测序检测拷贝数变异可能存在的漏检风险，MET扩增二代测序报告阴性时，仍可考虑FISH复测。以组织为参照，血浆检测 MET 扩增现有数据表明其灵敏度低，在报告中应予以必要的说明，血浆检测仅供临床参考，检测阴性不能排除MET扩增
10.其他靶分子的检测策略有哪些？
答：1.HER2、BRAF、KRAS、RET、NTRK 等：除了上述靶分子外，HER2 基因突变或扩增、BRAF 突变、KRAS 突变、RET 基因重排、NTRK 家族基因重排等，均为 NSCLC中重要的驱动基因变异，并是潜在的治疗靶点
HER2 是酪氨酸激酶受体ERBB 家族成员之一，HER2 基因突变或扩增是NSCLC的驱动基因之一，其中最常见的基因变异为HER2外显子20插入性突变，在NSCLC的突变率为2%~4%
BRAF 突变可导致 MAPK/ERK 信号通路 异 常 活 化 ，BRAF 突 变 常 见 位 点 为 V600，在NSCLC 中 变 异 频 率 为 1%~2%
亚 洲 人 群 中KRAS 基因突变率为 8%~10%，突变位点位于外显子2及3，易发生在吸烟的肺腺癌患者，并且易伴发其他基因变异，如 LKB1、p53、CDKN2A/B 等，KRAS突变与患者预后差、耐药等相关
NSCLC中RET融合基因变异频率为 1%~4%，最常见的 RET 基因融 合 伴 侣 为 KIF5B（70%~90%）和 CCDC6（10%~25%），美 国 食 品 药 品 管 理 局（FDA）已 批 准Selpercatinib 和 Pralsetinib 用于伴有 RET 易位的肿瘤，国内亦有普拉替尼进入优先审批
NTRK 融合基因在 NSCLC 中罕见，发生率小于 0.1%，美国FDA 已批准 Larotrectinib 及 Entrectinib 用于 NTRK融合阳性的实体瘤的靶向治疗
TMB：目前还没有通用标准值和检测流程，但在部分临床研究和实践中已经在使用的生物标志物，涉及二代测序Panel设计及算法，以及肿瘤人群数据的划分，相对复杂，国际上也暂无指南共识，仅有个别检测方法获批，因此还需要更多的临床试验及真实数据的验证
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中华医学会病理学分会,国家病理质控中心,中华医学会肿瘤学分会肺癌学组,中国抗癌协会肺癌专业委员会,中国胸部肿瘤研究协作组.非小细胞肺癌分子病理检测临床实践指南（2021版）[J].中华病理学杂志,2021,50(4):323-332.
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