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【2020ASH-LBA5】磷酸乙醇胺可逆转不典型慢粒中ETNK1突变所致突变体表型

2020年12月08日

编译：肿瘤资讯

来源：肿瘤资讯

美国血液学年会（ASH）成立于1958年，是全球最大的血液疾病病因及治疗的专业协会，其使命在于促进血液病研究及诊治水平的提升。2020年12月2日~8日，第62届ASH首次以线上形式召开，会议汇集了世界各地的血液肿瘤专家，将公布多项重磅研究结果。Diletta Fontana教授等报告了对不典型慢粒中ETNK1突变治疗分析结果（摘要号：LBA6），体外治疗中磷酸乙醇胺（P-Et）可竞争性结合在琥珀酸脱氢酶催化结构域，降低线粒体活性及ROS产生，使突变体表型恢复。

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ETNK1 Mutations in Atypical Chronic Myeloid Leukemia Induce a Mutator Phenotype That Can be Reverted with Phosphoethanolamine

摘要号：LBA-5

时间：2020年12月8日, 7:00 AM-9:00 AM

研究背景

ETNK1激酶可将乙醇胺磷酸化为磷酸乙醇胺（P-Et）（Kennedy，1956，J Biol Chem）。约13％的非典型慢性粒细胞白血病（aCML）患者，3-14％的慢性粒细胞性白血病（CMML）和20％的嗜酸性粒细胞增多的系统性肥大细胞增多症（SM）患者中可见ETNK1基因的重现性体细胞突变（Gambacorti-Passerini, 2015, Blood; Lasho, 2015, Blood Cancer J）。编码H243Y、N244S/T/K和G245V/A氨基酸替代的ETNK1突变，聚集于ETNK1催化结构域的一个非常狭窄的区域，可导致ETNK1酶活性下降，从而使细胞内P-Et浓度显著下降（Gambacorti-Passerini, 2015, Blood）。然而其致癌作用在很大程度上仍无法用这些结论解释。

研究方法

本研究中，研究者使用细胞CRISPR / Cas9和ETNK1基因过表达模型以及aCML患者的样本研究了ETNK1基因突变的特定作用机制。

研究结果

研究者发现，ETNK1突变导致线粒体活性显着增加（与WT相比增加1.87倍；p = 0.0002）和ROS产生增多（与WT相比增加2.05倍；p <0.0001）。由于ROS可致DNA氧化损伤，研究者首先使用针对氧化鸟嘌呤（oxoG）的抗体对ETNK1突变的细胞生成了ChIP-Seq数据，然后将oxoG信号与野生型细胞系进行比较，以评估ETNK1突变是否会引起DNA损伤的累积。该分析表明，与WT相比，突变细胞中的oxoG显着增加（p=0.018）。然后，通过将6-硫鸟嘌呤（6-TG）耐药性检测应用于研究者的细胞模型，来研究这些突变是否可推动突变体表型的发作，结果显示，与WT相比，突变细胞中集落数量增加了5.4倍(p<0.0001)。此外，研究者研究了ROS介导的ETNK1突变体的基因毒性损伤是否也与DNA双链断裂的增加有关。ETNK1-N244S和ETNK1-WT细胞系的比较显示，前者的γH2AX灶数量急剧增加（增加2.52倍；p=0.0002）。在这一点上，研究者假设在ETNK1突变的细胞中P-Et浓度降低可能是线粒体活性增加的原因。经P-Et处理的ETNK1-N244S细胞线粒体膜电位和ROS生成完全恢复正常。此外，P-Et处理后，突变体表型恢复，这支持了P-Et直接参与DNA损伤诱导的假设。为了解细胞内P-Et水平控制线粒体活性的机制，研究者分离了线粒体氧化磷酸化复合物Ⅰ-Ⅳ，并测量在P-Et浓度升高或不升高时每种复合物的活性。这种方法显示了线粒体复合物II氧化还原活性的显著剂量依赖性降低（P-Et 10μM：降低1.80倍; p = 0.0012; P-Et 20μM：降低7.40倍; p <0.0001; P-Et 50μM：降低28.85倍；p <0.0001），而对其他三种复合物几乎没有影响，提示P-Et通过直接抑制复合物Ⅱ控制线粒体电位。为进一步了解P-Et抑制复合物Ⅱ的具体机制，研究者在P-Et和浓度不断增加的琥珀酸盐（琥珀酸脱氢酶[SDH]的内源性底物）存在下的竞争分析中分析了其活性，显示了从50µM开始琥珀酸盐的补充能够恢复SDH的正常活性。总体来看，这些数据提示P-Et可以作为琥珀酸盐影响SDH活性的竞争性抑制剂。据此，P-Et在SDH催化结构域内的自动对接证实，P-Et可以在能量优势构象中占据琥珀酸盐结合位点，模拟琥珀酸盐功能。

结论

综上，突变体ETNK1活性降低导致P-Et与琥珀酸竞争减少，线粒体活性增加和ROS产生，从而导致新突变的积累。至少在体外，可以通过补充P-Et来抑制这种机制，从而抑制由ETNK1依赖性突变体表型介导的新突变的积累。体内治疗研究将揭示P-Et的治疗潜力。

参考文献

https://ash.confex.com/ash/2020/webprogram/Paper14385.

责任编辑：肿瘤资讯-Amiee
排版编辑：肿瘤资讯-亚楠