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替诺福韦前药通过靶向EB病毒DNA聚合酶有效抑制EB病毒裂解期DNA复制

2020年12月02日

作者：胡灵灵，桑威
单位：徐州医科大学附属医院血液科淋巴瘤中心

来源：肿瘤资讯

EB病毒是一种潜在的致瘤病毒，在宿主体内存在有潜伏感染和裂解感染两种形式，持续的裂解感染是诱导EBV相关疾病的主要原因。近年来，围绕靶向EBV的治疗一直在不断探索，其中针对抗EBV的免疫细胞治疗，小分子靶向治疗，取得了一定的进展，而针对EBV的抗病毒药物治疗一直未能取得突破。该研究首次证实，替诺福韦可以在体外通过作用于DNA聚合酶，有效抑制EBV的病毒复制，为临床治疗EBV相关疾病带来了新的希望。

桑威

医学博士，副教授，副主任医师，硕士生导师

徐医附院细胞研究和转化医学中心副主任
徐医附院血液科科副主任
徐医附院血液科淋巴瘤诊疗中心副主任
中华医学会血液学分会淋巴细胞疾病学组委员
中华医学会血液学分会感染学组委员
中国抗癌协会淋巴瘤专委会委员
中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会青年委员
中国抗癌协会血液肿瘤委员会慢淋工作组委员
中国老年医学会血液学分会淋巴瘤学组委员
江苏省淋巴瘤联盟副主席
江苏省医学会血液学分会淋巴瘤/骨髓瘤学组委员
江苏省医学会血液学分会抗感染学组委员
江苏省“六大人才高峰”培养对象
江苏省“科教强卫工程”青年医学人才

胡灵灵

导师：桑威教授
徐州医科大学附属医院血液内科2020级硕士研究生

研究背景

EB病毒(EBV)是一种人类Ⅳ型疱疹病毒，95%的健康人终身携带，2%的癌症发生和BEV感染相关。EBV感染明显增加了一些癌症和自身免疫性疾病的发展风险。EBV的持续裂解感染，在驱动EBV相关癌症的发生发展中，起着最核心的作用。潜伏状态的EBV病毒有完备的自我复制机制，完全不依赖于DNA聚合酶。而依赖于DNA聚合酶的裂解感染，则有希望获得有效的抗病毒药物。因此，有效的抑制EBV的激活，有希望预防EBV相关疾病的发生。目前现有的抗病毒药物，例如阿昔洛韦(ACV)、伐阿昔洛韦(VACV)、更昔洛韦(GCV)、伐更昔洛韦(VGCV)等，由于低效力或高毒性，无法实现对EBV裂解感染的抑制。临床上尤为期待能有低毒高效的抗EBV药物可用。

研究目的

该研究通过比较富马酸替诺福韦二吡呋酯(TDF)和富马酸丙酚替诺福韦(TA F)相对于ACV、GCV等靶向DNA聚合酶的抗病毒药物，探索针对EBV裂解感染的高效低毒的抗EBV病毒药物的有效性和安全性。

研究方法

EBV裂解诱导：将EBV阳性的HH514-16细胞接种于含青霉素、链霉素和两性霉素B的RPMI-10%胎牛血清中，使用丁酸钠诱导EBV 裂解期DNA的复制，抗病毒药物溶解在特定浓度的二甲亚砜(DMSO)中。

重组EBV的DNA聚合酶测定：利用PCR方法将EBV DNA聚合酶亚基BMRF1和BALF5克隆到pcDNA3.1+载体中。重组蛋白通过Promega TnT T7偶联网织红细胞裂解系统表达，利用FluoroTect GreenLys体外翻译标记系统、凝胶电泳、荧光成像测定网织红细胞裂解期中蛋白的表达。使用PD-10 Sephadex-G25柱对重组聚合酶蛋白进行脱盐，去除干扰盐或核苷酸。

结果

本研究中发现TD F和TA F可以抑制EBV裂解期DNA复制，其IC50值分别为0.30uM和84nM。在细胞水平实验中，以核苷类似物ACV、GCV、PCV作为阳性对照，TD F和TA F抑制EBV裂解期DNA复制的效力优于ACV和GCV，TA F的效力优于PCV。TDF的IC50值分别低于ACV和喷昔洛韦（PCV）的10倍和7倍，TAF的IC50值低于GCV的2倍，PCV 的24倍，ACV的 35倍（如图1）。

图1. TAF是EBV裂解期DNA复制的高效抑制剂

用Westernblot方法检测药物治疗72h后病毒早期抗原Ea-D的蛋白表达。结果显示 Ea-D表达不受TAF的影响，提示TAF没有阻断早期诱导，TAF通过作用于通路下游来阻断EBV裂解期DNA复制。EB病毒聚合酶活性需要BALF5和BMRF1(图2B)，GCV-TP是最有效的EBVDNA聚合酶抑制剂，较替诺福韦二磷酸（TFV-DP）的效力高5倍，较阿昔洛韦三磷酸（ACV-TP）的效力高13倍（如图2F）。

图2.png

图2. TFV-DP通过dATP竞争抑制EBV DNA聚合酶

TAF与ACV相反，药物治疗期间，细胞在药物去除后72h，其潜伏期仍能抑制EBV DNA的复制，但预处理为ACV的细胞却无抑制EBV DNA作用，这表明TAF拥有可以在裂解期前进行治疗的优势（如图3）。

图3.png

图3. TAF在诱导裂解前治疗仍然有效

结论

本研究数据结果表明TDF和TAF是靶向EBV-DNA聚合酶的有效抑制剂，具有良好的安全性；也是目前唯一体外数据证实针对EBV裂解感染高度有效的抗EBV的药物。该研究结果为临床制定靶向抗EBV的治疗策略，提供了理论依据。对于未来预防和治疗EBV相关淋巴瘤以及实体瘤等治疗，提供了新的治疗思路，具有重要的参考价值。

参考文献

Drosu NC, Edelman ER, Housman DE. Tenofovir prodrugs potently inhibit Epstein-Barr virus lytic DNA replication by targeting the viral DNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 2020;117(22):12368-12374. doi:10.1073/pnas.2002392117.

责任编辑：Amiee
排版编辑：亚楠