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NCCN 非小细胞肺癌临床实践指南2019.1版（8）

2018年11月15日

作者：蔡修宇黄志锋

来源：“指南解读”微信公号

分子学检测和生物标志物分析原则（NSCL-G）

NSCL-G,1/5

分子学检测的注意事项、标本要求、检测方法

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非小细胞肺癌的分子诊断学检查

●已确定许多基因的变异会影响治疗方案的选择。检测肺癌标本的这些基因变异，对于确定潜在有效的靶向治疗以及避免不太可能提供临床获益的治疗是重要的。

●用于选择靶向治疗的一些方法包括预测性免疫组化分析，这与用于确定肿瘤类型和谱系的免疫组化检查不同。

●对分子学结果的应用和解读至关重要的分子学检测的主要要素包括：

在经过适当认证的实验室进行检测，至少有CLIA认证
理解所使用的方法学以及这些方法的主要局限性
理解通过一种特定分析方法可检测变异的范围（以及那些未检测的变异）
在检测前，了解肿瘤标本是否进行过病理学检查和肿瘤富集（即显微切割、肉眼分离）
检测实验室接受的样品类型

●标本采集和管理：

虽然肿瘤检测已主要集中在使用福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）的组织，但是，越来越多的实验室接受其它类型的标本，尤其是未通过FFPE流程处理的细胞病理学涂片。尽管FDA批准的多种伴随诊断分析不包括对细胞块的检测，但是当它是唯一或最好的材料时，强烈建议对这些样本类型进行检测。
当使用微创技术获取的样本来进行非小细胞肺癌的分子学检测时，存在的一个主要局限性是：样本量可能不足够用于分子、生物标志物以及组织学检查。因此，为了能够进行所有适当的检测，支气管镜操作医生和介入放射科医生应该获取足够的组织。
当组织极少时，实验室应有效地利用技术来最大限度地利用组织进行分子学和辅助检查，包括小活检样本组织学检查专用协议、包括用于诊断和预测性检测的“预”滑动切片。

●检测方法

以下分别列出每一种适当可行的检测方法；然而，通常考虑联合使用几种方法：

1.二代测序（NGS）用于临床实验室。单独NGS分析并不能检出所有变异类型，熟悉单独分析或联合分析可识别的变异类型是很重要的。

2.实时聚合酶链反应（PCR）是一种具有高度针对性的检测方法（针对特定突变）。采用该技术只能针对那些特定的改变进行检测评估。

3.桑格测序需要最大程度的肿瘤富集。未改良的桑格测序不适合用于富集后肿瘤含量仍不足25%-30%的标本的突变检测，且重要的是要认识到它不适合用于分析识别亚克隆事件（如耐药突变）。如果使用桑格测序，几乎都建议使用肿瘤富集方法。

4.可使用的其它方法，包括上面未列出的复合方法，如SNaPshot技术（美国应用生物公司(ABI)开发,是一种基于荧光标记单碱基延伸原理的分型技术，也称小测序，主要针对中等通量的SNP分型项目）、MassARRAY（核酸质谱分析系统]）。

5.荧光原位杂交（FISH）分析用于拷贝数、扩增以及结构改变如基因重排等许多分析检查。

6.免疫组化（IHC）专门用于某些特定分析，可作为一个有用的替代或其它分析的筛选方法。

NSCL-G,2/5

EGFR和ALK

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●分析的分子靶点

一般而言，观察到的下述突变/变异是非重叠的，尽管有1%–3%的非小细胞肺癌可能有并存的变异。
EGFR（表皮生长因子受体）基因突变：EGFR是一种受体酪氨酸激酶，通常见于上皮细胞表面，经常在多种人类恶性肿瘤中过表达。

1.最常描述的EGFR突变（19外显子缺失、21外显子p.L858R点突变）与对EGFR酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗起效相关；最新数据表明，没有EGFR敏感突变的肿瘤在任何线的治疗中均不应使用EGFR TKI。

2.许多较不常见的EGFR变异，累计占EGFR突变NSCLC的～10%（即19外显子插入、p.L861Q、p.G719X、p.S768I）也与对EGFR TKI治疗起效相关，尽管研究的患者数较少。

3.某些EGFR突变与对EGFR TKI治疗缺乏疗效相关，包括大多数的EGFR 20外显子插入和p.T790M。

— 大多数的EGFR 20外显子插入突变预示着临床上对TKI耐药。

— 一种罕见的EGFR 20外显子插入变异（p.A763_Y764insFQEA）是例外，它与对EGFR TKI治疗起效相关。因此，对EGFR 20外显子插入的认识必须包括明确的序列改变。

— 与EGFR TKI初始治疗后复发相关最常见的变异是p.T790M，是一种已知的耐药机制。如果确定先前用过TKI，应考虑行遗传咨询，因为胚系p.Ｔ790m与家族性肺癌易感性相关，因此，有必要进行进一步检测。

4.随着NGS检测使用的增加，发现了越来越多的其它EGFR变异；然而，不太可能很好地确认个体变异的临床意义。

5.某些临床病理特征（如吸烟状况、种族、组织学）与EGFR突变的存在相关；然而，这些特征不应用于挑选进行检测的患者。

6.检测方法：检测EGFR突变状态的方法有实时PCR、桑格测序（理想的是配以肿瘤富集）以及最常用的NGS。

ALK（间变性淋巴瘤激酶）基因重排：ALK是一种受体酪氨酸激酶，可在非小细胞肺癌中重排，导致通过ALK激酶域的信号失调和失当。

1.ALK最常见的融合伴侣是棘皮类微管相关样蛋白4（EML4），尽管已经发现了许多其它融合伴侣。

2.存在一种ALK重排与对ALK TKI起效相关，最近的研究表明，在一线情况下，艾乐替尼的疗效优于克唑替尼。

3.某些临床病理特征（如吸烟状况和组织学）与ALK重排的存在相关；然而，这些特征不应用于挑选进行检测的患者。

4.检测方法：分离FISH探针是第一个被广泛采用的方法。免疫组化可作为一种有效的筛选策略。FDA批准的IHC（ALK [D5F3] CDx分析）可作为独立检测，不需要FISH确认，尽管鼓励使用第二种方法进行确认。许多NGS方法可以检测ALK融合，在某些情况下使用定向实时PCR法，虽然不太可能发现与新的伴侣融合。

NSCL-G,3/5

ROS1、BRAF和KRAS

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ROS1（ROS原癌基因1）基因重排：ROS1是一种受体酪氨酸激酶，可在非小细胞肺癌中重排，导致通过ROS1激酶域的信号失调和失当。

1.ROS1有许多融合伴侣，常见的融合伴侣包括：CD74、SLC34A2、CCDC6和FIG。

2.存在一种ROS1重排与对口服ROS1 TKI起效相关。

3.某些临床病理特征（如吸烟状况和组织学）与ROS1重排的存在相关；然而，这些特征不应用于挑选进行检测的患者。

4.检测方法：可以采用分离FISH探针法；然而，它可能检测不出FIG-ROS1变异。可以采用IHC；然而，免疫组化用于检测ROS1融合的特异性低，因此如果使用ROS1 IHC作为一种筛查手段，后续的验证性检测是一个必要的组成部分。许多NGS方法可以检测ROS1融合，在某些情况下使用定向实时PCR法，虽然不太可能发现与新的伴侣融合（可能检测不出ROS1融合事件）。

BRAF（B-Raf原癌基因）点突变：BRAF基因是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，是典型的MAP/ERK信号通路的一部分。BRAF激活突变导致通过MAP/ERK通路的信号失控。

1.BRAF突变可见于非小细胞肺癌中。已发现一个导致p.v600e改变的特定突变的存在与联合口服BRAF与MEK抑制剂治疗起效相关。

2.应注意BRAF的一些其它突变也可见于非小细胞肺癌中，这些突变对治疗选择的影响目前尚不太清楚。

3.检测方法：检测BRAF突变状态的方法有实时PCR、桑格测序（理想的是配以肿瘤富集）和最常用的NGS。尽管抗-BRAF p.V600E特异性单克隆抗体可在市场上买到，而且在一些研究中使用了这种方法进行检查，但是，只能在经过大规模的验证之后才能使用。

KRAS（KRAS原癌基因）点突变：KRAS是一个本身具有GTP酶活性的G-蛋白，活化突变将导致通过MAP/ERK通路的信号失控。

1.在非小细胞肺癌中的KRAS突变最常见于12密码子，虽然可以见到其它部位的突变。

2.与肿瘤无KRAS突变的患者相比，存在一种KRAS突变预示生存期差。

3.KRAS突变与对EGFR TKI治疗的疗效降低相关。

4.由于出现可以靶向的重叠变异的可能性较低，因此，存在一种KRAS突变或许可以识别将不会获益于进一步分子检测的患者。

●靶向治疗中进展情况下的检测：

对于上述列出的许多分析物，人们对治疗耐药分子机制的认识逐渐增加。对靶向治疗中活跃进展的标本进行重新检测，可为制定下一步合理的治疗方案提供线索：

1.对于已经接受过EGFR TKI治疗、具有潜在EGFR敏感突变的患者，合理的检测最起码应包括高敏感性的p.t790M评估；当没有p.T790M的证据时，检测其它耐药机制（MET扩增、ERBB2扩增）来指导患者接受其它治疗。p.T790M是否存在，可指导患者接受第三代EGFR TKI治疗。

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靶向治疗中进展情况下的检测、免疫组化（PD-L1,ALK融合,ROS1融合,BRAF p.V600E突变）

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●靶向治疗中进展情况下的检测（续）

— 检测EGFR p.T790M的分析法，分析灵敏度应该至少有5%的等位基因分数。如果p.T790M是在亚克隆事件中，初始敏感突变可用作许多分析的内部对照，以确定p.T790M是否在检测范围内。

1.对于已接受过ALK TKI治疗、具有潜在ALK重排的患者，尚不清楚识别特定酪氨酸激酶域突变是否可以确定下一步的合理治疗方案，尽管一些初步数据表明一些特定激酶域突变可影响下一线治疗。

●用于非小细胞肺癌生物标志物选择的IHC：

PD-L1（程序性死亡配体1）：PD-L1是一个可以表达于肿瘤细胞的共调节分子，抑制T细胞介导的细胞死亡。T细胞表达PD-1，一个负调控因子，与配体（包括PD-L1[CD274]或PD-L2[CD273]）结合。存在PD-L1时，T细胞活性被抑制。

1.检查点抑制剂抗体阻断PD-1和PD-L1的相互作用，从而提高内源性T细胞的抗肿瘤作用。

2.可以利用IHC检测PD-L1以识别最可能对一线抗PD-1/PD-L1治疗起效的肿瘤。

— 已经开发出用于IHC分析PD-L1表达的各种不同的抗体克隆，一些呈现相对等价，一些则不等价。

— PD-L1 IHC的判读通常关注表达任何水平膜染色的肿瘤细胞的比例，因此是一种线性变量。

— FDA批准的适合接受帕博利珠单抗一线治疗的PD-L1 IHC染色肿瘤细胞比例临界值是50%，适合接受帕博利珠单抗二线治疗的临界值是1%。

— 检测结果阳性和阴性的界定取决于使用的特定抗体和平台，其对每一种检查点抑制剂治疗可能是唯一的。有可能用于检测PD-L1的多种不同方法已增加了病理科医生和肿瘤科医生的困扰。

ALK融合：IHC检测ALK可作为进一步ALK检测的一个筛查手段，并可作为一个独立的检测用以确定是否适合接受ALK TKI治疗。FDA已批准了一种检测ALK的IHC。
ROS1融合：IHC检测ROS1仅可用作进一步ROS1检测的一个筛查手段，因为阳性结果的特异性低。在没有另外的验证性检测的情况下，ROS1 IHC阳性不应该用来筛选适合接受TKI治疗的患者。

目前还没有FDA批准的检测ROS1的IHC。