编译：月下荷花
来源：肿瘤资讯
结直肠癌是一组异质性疾病，组学分类能更好的细化每种结直肠癌的特征，重要的是有的放矢的治疗，以取得更好的疗效。下面一起来学习结直肠癌的共识分子亚型对精准医疗的指导作用以及未来研究与治疗的发展方向。
现代化疗可使转移性结直肠癌（mCRC）中位总生存达18-20个月，加入靶向药物后升至30个月。许多生物学标志能预测靶向药物疗效，随着对CRC基因组学和转录组学亚型以及压力选择下肿瘤时空异质性的深入理解，促进了药物-生物标志的共同发展。西班牙Dienstmann 教授在NAT REV CAN 上发文，介绍了CRC转化研究方向、患者分层与组学指导治疗，并提出分子特征与靶向药物的综合分类以及对CRC精准治疗未来的构想。
CRC分子研究
1.驱动改变、基因组和表观基因组亚型
已发现与CRC发生发展有关的几个基因和途径。Vogelstein的基因和表观基因的累积变化导致腺瘤和腺癌形成的模型说明抑癌基因突变的驱动作用和原癌基因突变赋予CRC生长和进展优势，非随机突变影响与CRC发生相关的细胞分化、增殖和凋亡途径。基因组学研究显示WNT-β-连环蛋白、TGFβ、EGFR和下游MAPK及PI3K途径在几乎所有CRC中都有改变。
研究显示类结肠器官在APC、TP53、SMAD4、KRAS和PIK3CA等基因突变时，即便无微环境作用也可生长，不过只有在染色体不稳定（CIN）和驱动突变共存时才具有侵袭性并形成转移。85%侵袭性CRC（图1）均存在非整体染色体和杂合性缺失，CIN的产生与染色体聚集、端粒稳定性和DNA损害反应缺陷有关，TP53及节点基因突变也与之相关。
一部分CRC为DNA错配修复缺陷，导致过甲基化和微卫星不稳定（MSI），基因组学研究显示MSI肿瘤为高CpG岛甲基化表型（CIMPhi），许多与肿瘤发生相关基因过甲基化，传统腺瘤与CIN CRC有很多相似分子特征，不过无蒂锯齿腺瘤的最初驱动事件是CIMPhi和MSI。
CIN肿瘤和MSI肿瘤的遗传学和表观遗传学事件的顺序与模式并不相同，但异常调节途径却是重合的（图2）。所有CRC亚型中均可见到KRAS突变，但BRAFV600E突变在MSI和CIMPhi肿瘤中增多。DNA多聚酶ε（由POLE编码）体突变导致CRC中最高比率的突变，但此类肿瘤缺少MSI、CIMPhi和MLH1过甲基化。ALK、NTRK1、NTRK2、NTRK3或RET因融合导致激酶活性增强事件少见，在基因组或表观基因组亚型中也无特殊分布。
2. 共识转录组学亚型
基因表达与细胞表型和肿瘤行为密切相关，CRC共识分子分类（CMS）包括四种亚型（图1），是目前基因水平对CRC异质性的最佳描述，通过对组学CRC特征分析能加深对每个CMS生物学特征的理解：（1）多数MSI肿瘤集中在CMS1组（免疫表型），特征是过突变、过甲基化、BRAFV600E突变较多，免疫细胞明显浸润肿瘤微环境，特别是CD8+CTLs、CD4+TH1和NK细胞；（2）CIN肿瘤分成三组，CMS2经典型，CMS3代谢型， CMS4间充质型。
CMS2和CMS4体突变模式无显著差别，均为MSS和低水平过甲基化，CMS2的WNT和MYC下游明显上调，较高表达EGFR、HER2，IGF2、IRS2、HNF4A和周期蛋白，CMS4为上皮-间充质转化（EMT）和干细胞化途径活化，与细胞外基质重塑和补体信号相关的蛋白过表达，对微环境血管和基质有生成作用，事实上间充质表型肿瘤的信号活化多来自邻近癌组织浸润的基质细胞，特别是癌症相关成纤维细胞（CAFs）。CMS2和CMS4活化途径不同，CMS4更高风险发生远处复发和死于早期疾病。
CMS3的基因组和表观基因组明显不同于其它CIN，少有拷贝数改变，30%的CMS3表现为MSI，过突变和中等水平过甲基化。CMS3上皮型肿瘤的主要特征是代谢重组，富含KRAS活化突变。每个CMS分型的细胞起源并不清楚，基因分析显示上下结肠陷窝分别与CMS3和CMS2相关。
3. 免疫亚型进展
Galon证实CRC中较高淋巴细胞浸润，特别是CTLs和TH1浸润，无复发和总生存更优，而TH17浸润则预后差，因此建立了免疫评分系统，可用于早期CRCs预后评估，高分者肿瘤复发风险下降50%。晚期CRC时B细胞和滤泡辅助T细胞增多提示无病生存更佳， FOXP3转录因子表达增多的CD4+T细胞能妨碍对癌细胞的免疫反应，显示预后差。
如图3所示，DNA错配修复缺陷CRC表现为MSI或过突变，CTLs和TH1浸润增多，可抵消多个免疫节点如CTLA4、PD1、PDL1和IDO1的上调作用，CTLs的密度与框架飘移突变数量有关，提示基因组事件产生免疫原性新肽段，由特异淋巴细胞识别，同时肿瘤高水平表达如下途径基因：与TH1表型相关、形成三联淋巴样结构、细胞因子趋化T细胞和JAK-STAT免疫信号途径。
另有一组肿瘤高表达如下途径相关基因：Treg细胞、髓系衍生抑制细胞（MDSCs）、单核细胞衍生细胞和TH17，主要见于免疫耐受肿瘤微环境，免疫抑制因子明显上调，高表达CCL2、IL-23和IL-17等（均是结肠炎相关CRC驱动因子），此亚型和EMT的生物学一致，CMS4肿瘤基质浸润上皮细胞、CAFs和固有免疫细胞，预后差部分归因于促转移的免疫逃疫性微环境。这表明早期CRC此种类型的活化微环境是远处转移的风险因素，结肠炎相关CRC临床侵袭性更强。
多数CRC（主要为CMS2和CMS3）显示低免疫性和炎症特征，缺少浸润肿瘤的淋巴细胞和免疫调节因子，通常PDL1阴性，提示免疫原性差。WNT-β-连环蛋白途径在多数上皮肿瘤中活化，与T细胞浸润减少有关，需要更多研究。
4.CRC进展期间分子异质性
CRC不但肿瘤间存在异质性，个体肿瘤也存在时空异质性，目前研究多限于基因组学，结果发现已知的驱动癌基因突变相互排斥，EGFR单抗继发耐药时原发-转移灶间的基因组异质性反应了治疗压力造成的克隆选择。
很多初始野生型KRAS患者治疗后发生MAPK途径突变（图4），其中1/3多种突变共存，其中许多是源于原发肿瘤中早已存在的小克隆，ctDNA分析显示KRAS突变率随着抗EGFR治疗快速增加，停药后快速下降，再次抗EGFR治疗后又快速增加。此外有些EGFR突变能影响蛋白胞外抗体结合区域，只在治疗后肿瘤可检测到，常与KRAS共存。EGFR突变是驱动改变还是过路突变需要进一步研究。
多个研究结果显示原发肿瘤和转移肿瘤的基因表达模式和拷贝数量的变化很相似，与原发灶相比，转移灶基因组和转录基因组的获得性改变缺少可重复性，因此可以认为：驱动转移的生物学过程在癌症发生之初即已确定。此外原发灶与转移灶间微环境的异质性研究仍有待进一步深入。
肿瘤内异质性的空间分布能明确突变的时间顺序和肿瘤生长动态过程，研究显示疾病进展至晚期后亚克隆扩增和选择性略过并不常见，因此提出CRC生成的“大爆炸”理论，根据这一模型，CRC肿瘤虽有多个克隆和亚克隆改变，但只有某个优势生长，其它克隆细胞量很小。不过非主要的亚克隆改变与其它主要改变共同保证CRC进展。因此原发CRC基因组空间异质性利于加深对肿瘤生物学行为的理解，对精准医疗有潜在指导作用。
精准医疗模式的转换
临床试验的回顾性研究发现KRAS外显子2突变与抗EGFR耐药关联，这是首个精准CRC治疗模式，但很多KRAS野生型CRC也对抗EGFR治疗耐药，提示还存在其它突变。然而针对BRAF和MEK单个靶点抑制治疗的失败说明CRC靶向治疗中单药-单靶点模式有很大局限性。
现代研究能够鉴定CRC的共同驱动改变，新的少见的却更具驱动性的靶改变，能更好的了解靶点抑制的动态变化以设计更合理的药物组合，识别与耐药有关的异质性和克隆选择，这意味着CRC精准医疗由单药-单靶点向多基因-多药模式转化。例如联合抑制BRAF、MEK和EGFR治疗BRAFV600E突变CRC就是很好的例子。表1列举了进展期CRC治疗选择的阳性预测标志。不过多靶点药物尤其是下游途径不十分清楚时，如瑞格非尼，生物标志的鉴定存在很多问题。不过因为转录基因组和免疫CRC亚型的鉴定，可以联合多个分子标志预测治疗反应（图5）
EGFR抗体的原发和继发耐药是CRC生物学和动态进展的最好例证。接近70%的CRC在EGFR信号途径上有不同基因受累，导致抗EGFR耐药，因此KRAS和NRAS对EGFR阻滞的阴性预测作用是首次CRC亚分型，现已在治疗中广泛采纳。近20%KRAS野生型肿瘤中有极小量KRAS或NRAS突变克隆，是EGFR获得性耐药根源，支持原发与转移灶KRAS突变一致性，提示CRC复发时可能也保持原发时的基因组结构。
EGFR阻滞原发耐药受其它改变影响，包括BRAF、MEK1、ERBB2、FGFR1和PDGFRA，联合抑制上述靶点与EGFR靶点可获持续治疗反应。30%CRC患者KRAS、NRAS、BRAF和PIK3CA均阴性，更可能对抗EGFR治疗有反应，对双EGFR靶向治更敏感。基础研究显示EGFR阻滞后ERBB家族受体并行信号途径上调，致继发耐药，不过联合阻滞上述途径与EGFR未达预期疗效，可能与缺少可靠筛选标志有关。此外非遗传机制也在EGFR耐药中发挥作用，基础研究显示CRC的EGFR依赖具有保守性，围绕于此需要更多研究。
未来的多分子模式
1. 转录组学亚型的基因变化
CMS分类有较多基因组标志，转录组学特征有助于亚分类，例如RAS野生型CRC可以是不同CMS分类，对EGFR治疗有不同反应，解剖位置对治疗反应的影响可能是转录组学差别所致。近端肿瘤多为CMS1和CMS3，EGFR配体表达减少，远端肿瘤特别是CMS2亚型，经常过表达EGFR配体，EGFR和IRS2扩增（西妥昔单抗耐药标志）。RAS野生型间充质亚型对EGFR治疗原发耐药，能够增加EGFR单抗治疗CMS4作用的可能靶点包括MET和整合蛋白等。
RAS野生型CRC的治疗策略优化相对容易，而KRAS突变疾病治疗优化极为困难，肿瘤基因水平异质性极大，具有独特的代谢特征，以CM3肿瘤为主，新的代谢酶抑制剂正在临床研究中，可能会用于KRAS突变CRC的靶向治疗。
2.转录组学亚型的活化途径
不同的CMS亚型富含不同的可以靶向的特异途径，例如高度增殖性上皮样CRC细胞对光激酶抑制剂治疗反应增加。鉴定CMS4间充质肿瘤的靶点很有意义，此类肿瘤转移风险更高，回顾性分析显示间充质表型CRC在化疗中无获益，化疗与TGFβ受体抑制剂联合治疗“TGFβ活化”CRC的研究正在进行。UFO和NOTCH的活化也会启动CRC中的EMT，与肿瘤侵袭表型和靶向药耐药有关，CMS4 CRC中二个途径皆过度活化，可能成为新的治疗靶点。
3.转录组学亚型中的免疫活化
综合免疫和转录亚型可以指导新的免疫治疗策略，特别是炎症间充质CRC（图3）。TGFβ的促瘤作用包括直接作用肿瘤细胞，抑制杀瘤免疫细胞，还会增加负调节免疫细胞，因此免疫治疗要想成功治疗炎症间充质肿瘤，就需要激活效应CTL，还要抑制T细胞的抑制功能，这一设想已在动物模型中得到证实。另一种免疫治疗炎症间充质肿瘤的方法就是药物去除MDSCs或阻滞相关免疫抑制节点信号通路，这一点在其它免疫侵袭性肿瘤中已证实。
对免疫原性弱或无免疫性的CRC，需要在免疫节点抑制治疗基础上进行强化治疗，如癌症疫苗、组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂。
MSS肿瘤中免疫节点抑制剂单药治疗已失败，但仍有多个研究正在评估联合化疗或血管生成抑制剂治疗的作用，有结果显示MEK抑制联合抗PDL1治疗MSS CRC初步有效。另一个策略就是联合免疫调节剂与抗EGFR治疗RAS野生型CRC，总之免疫系统在治疗中发挥重要作用。
展望
CRC的生物学特征对指导靶向治疗很有帮助，鉴定分子一致的CRC亚类及驱动改变将会促进治疗发展。通过新技术不断了解CRC发生发展细节，建立“多基因-多药”的精准医疗模式，表2列出并讨论了该模式的情况。
首先，亚分类本身并不能预测药物反应，因为药物作用机制复杂或无法用静态的组学数据明确药物作用途径，而且患者体内分子异质性、基因组学和转录组学以及免疫活化的动态变化也需进一步评估。
其次药物与特殊基因或免疫CRC表型的关系只是源于基础研究假说或回顾性研究，仍需更多生物标志建立以进一步理解潜在作用机制。随着新易感性的鉴定，必然会有老药新用，此外新标志应与驱动突变、MSI状态、CMS和免疫CRC分类进行综合分析，自始至终应贯彻：研究基因分类对药物敏感性的影响；靶向药物与CMS分类的反应模式；对研究进行调整，通过分层进行相关性评估；新研究采用新标志评估药物和靶向治疗。当然CMS分类本身也需进一步研究。
第三联合靶向治疗既可获益也可导致毒性交叠。当疾病进展时检测到可靶向治疗的靶点时，就应调整治疗，不但靶向已出现的亚克隆，还要扼制肿瘤进化，后者通过间断靶向抑制交叉途径来延迟耐药克隆出现。即便肿瘤出现缩小，耐药细胞仍存在，因此要明确耐药如何产生并如何消除，免疫治疗在这方面研究最多，多种免疫节点抑制剂联合治疗已在探讨之中。
最后患者分层、药物发展策略已从转移性CRC治疗向辅助治疗方向发展，不过临床研究暂未得出阳性结果。未来以生物标志指导的辅助治疗中，更好地理解促癌状态的驱动因素将会指导药物选择，希望这样能增加CRC的治愈率和生存。
参考文献：
Rodrigo D,Louis V et al;Consensus molecular subtypes and the evolution of precision medicine in colorectal cancer.Nature Reviews Cancer 17, 79–92 (2017)
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