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【阔然开朗】单细胞+空间转录组+ mIHC 技术揭示肝细胞癌微环境的肿瘤免疫屏障

2023年11月03日

来源：肿瘤资讯

单细胞转录组测序（single-cell RNA-seq，scRNA-seq）可在单细胞水平揭示全基因组范围内所有基因的表达情况，非常有利于研究细胞间的表达异质性。然而，单细胞测序流程需要先将组织消化为单细胞悬液，这一过程会造成细胞空间位置信息的丢失。

空间转录组测序可以测量完整组织切片的总mRNA，将总mRNA的空间信息与形态学内容相结合，并绘制所有基因表达发生的位置，获得疾病复杂而完整的基因表达图谱。在确定不同细胞群的同时保留空间位置，为细胞功能、表型和组织微环境中位置的关系提供了重要信息。但空间转录组每个spot点中可能存在1-10个细胞，分辨率达不到单细胞分辨率。

近年来，随着多重免疫荧光mIHC技术的发展，对于组织原位蛋白标记物的检测数量更多，多重荧光免疫组化技术（mIHC）最多可以在同一张片子上标记9个蛋白，进而可以更好的分析组织微环境的组成结构和更详细的细胞分型，可以用于单细胞或者空间转录组测序的验证。单细胞多组学 + mIHC；空间转录组测序+ mIHC；或者单细胞+空间转录组测序+ mIHC 相结合被越来越多的应用于科学研究，助力于高分文章的发表。

2023年1月25日，由中国科学技术大学刘连新、王嘉倍、胡青松与上海交通大学叶幼琼的研究团队在国际知名肝癌研究权威杂志Journal of Hepatology（IF 30.083）发表了题为“Identification of a tumour immune barrier in the HCC microenvironment that determines the efficacy of immunotherapy”的研究论文，该研究将单细胞测序、空间转录组学、和多重荧光免疫组化技术相结合鉴定了HCC微环境中的TIB（肿瘤免疫屏障）结构，并发现SPP1 ⁺巨噬细胞和CAFs相互作用，促进TIB结构的形成，限制肿瘤的免疫浸润，在小鼠体内阻断SPP1或巨噬细胞特异性敲除Spp1可破坏TIB结构，使HCC对免疫治疗敏感。

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技术路线

研究结果

空间转录组测序揭示了与免疫治疗效果相关的TIB微环境结构

为了探索ICB治疗下TME结构的异质性，作者对8名抗PD-1治疗的HCC患者的肿瘤切片（无应答者，n=5；应答者，n=3）和相邻正常组织切片（n=3）进行了空间转录组测序（10x Genomics）。基于无监督聚类和spot特征，将肿瘤spots分为肝细胞、免疫/成纤维细胞、肌成纤维细胞/周细胞、SPP1⁺巨噬细胞/CAFs，以及恶性肝细胞。由于无法区分CAFs和SPP1⁺巨噬细胞，表明这两种细胞类型之间存在物理相互作用。作者发现，肿瘤细胞周围的SPP1⁺巨噬细胞/CAF簇在ICB非应答者中形成了TIB结构，但在应答者中却没有这种结构。SPP1⁺巨噬细胞/CAF的spots在肿瘤中特异性富集，ICB治疗无应答者的比例高于应答者（图1H-I）。此外，多重荧光免疫组化技术( mIHC )染色显示SPP1阳性αSMA阳性的细胞在肿瘤周围靠近，双阳性细胞对的数量在无应答者中显著高于应答者(图1K - L)，这表明这两种细胞类型之间的潜在串扰有助于形成与免疫治疗疗效相关的TIB结构。

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图1

ICB不响应的肝癌患者癌和癌旁组织的单细胞转录图谱

为了更好地了解ICB无应答者中TIB的细胞组成，作者对从6个ICB无响应患者的肝癌肿瘤和相邻正常组织进行了scRNA-seq（10x Genomics）。通过整合12个样本的所有细胞进行聚类分析，并定义主要细胞类型，定义出了六种主要细胞类型（图2A）。值得注意的是，髓系细胞和成纤维细胞的比例在肿瘤中显著增加（图2B）。肿瘤和邻近正常组织之间浸润细胞类型的差异表明，TME的动态重构在无响应的HCC患者中起着重要作用。

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图2

SPP1⁺巨噬细胞在肿瘤组织中显著富集

为了进一步探索具有TIB结构的ICB非应答者中髓系细胞的异质性，作者12个样本中髓系细胞为12个亚型，发现SPP1⁺巨噬细胞作为一个独立的亚型存在，并可能在TME中发挥重要作用（图3A）。通过比较髓系亚型在肿瘤和正常组织之间的比例，发现SPP1⁺巨噬细胞的百分比在肿瘤中显著增加（图3B）。流式分析显示，肿瘤组织中的SPP1⁺巨噬细胞浸润在无应答者中显著高于应答者（图3C）；接下来使用mIHC染色证实了CD68和SPP1蛋白共定位的SPP1⁺巨噬细胞在HCC肿瘤中富集（图3D）。

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图3

CAFs与SPP1 ⁺巨噬细胞的相互作用与TIB结构的形成有关

为了分析另一种TIB成分CAFs的细胞组成，作者将肿瘤和邻近正常组织的scRNA-seq数据集中的成纤维细胞亚分类为四种亚型（图4A），比较了肿瘤组织和正常组织间的亚型差异，发现CAFs主要富集在肿瘤组织。接着，作者将scRNA-seq数据集结合空间转录组数据集进行分析，发现SPP1⁺巨噬细胞和CAF可能在TIB结构中物理相互作用，SPP1⁺巨噬细胞和CAFs的共定位可能与细胞迁移、粘附和ECM组织有关。SPP1⁺巨噬细胞和CAFs之间配体-靶点相互作用的靶基因极有可能属于细胞因子-细胞因子-受体相互作用、ECM途径、TNF信号通路和IL-17信号通路。通过研究，发现SPP1⁺巨噬细胞和CAFs紧密位于TIB中，并通过相关配体受体相互作用，促进TIB结构的形成。

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图4

CAFs与SPP1 ⁺巨噬细胞的相互作用与TIB结构的形成有关

为了探索SPP1⁺巨噬细胞/CAFs在TIB中的潜在作用，作者评估了SPP1⁺巨噬细胞/CAFs和恶性肝细胞与其他空间细胞簇的相互作用权重，研究发现，在ICB无应答者中，SPP1 ⁺巨噬细胞/ CAFs簇与恶性肝细胞的相互作用权重最强，但与免疫细胞的相互作用较弱；而在应答者中，SPP1 ⁺巨噬细胞/ CAFs、成纤维细胞和免疫细胞与HCC的相互作用权重相当（图5A,B）。同时发现在ICB无响应的患者中，在SPP1 ⁺巨噬细胞/ CAFs周围未发现CD8⁺T细胞的浸润（图5C），在不具有TIB结构的ICB应答者中观察到免疫细胞浸润（图5D）。此外，mIHC染色显示SPP1 +巨噬细胞倾向定位于肿瘤边界，而CD8 + T细胞定位于TIB外而非ICB无应答者的肿瘤核心(图5E)，而应答者肿瘤中SPP1 ⁺巨噬细胞浸润较少，CD8 ⁺ T细胞浸润较多(图5F)。总之，这些结果表明SPP1 ⁺巨噬细胞相关的TIB结构的形成可能有助于HCC的免疫抑制微环境。

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图5

靶向SPP1破坏TIB结构，使HCC对免疫治疗敏感

由于SPP1是一种分泌型糖磷蛋白，其表达与HCC的免疫抑制微环境密切相关，因此敲除SPP1可以消除CAFs对免疫微环境的抑制作用，从而使杀伤性T细胞浸润肿瘤核心。为了验证这个想法，研究用(Spp1^f/f;Lyz2-Cre)小鼠建立了肿瘤模型，与Spp1^f/f小鼠相比，抗pd -1治疗Lyz2-Cre小鼠肿瘤生长速度明显下降，治疗效果较好（图6A）。流式细胞术分析显示，抗PD - 1治疗显著增加了肿瘤浸润CD8 + T细胞（图6B）和Granzyme B⁺ CD8⁺ T细胞在肿瘤区的数量（图6C）。mIHC染色结果验证了抗PD-1治疗的Spp1^f/f；Lyz2-Cre小鼠的肿瘤区CD8⁺ T细胞的Granzyme B染色强度显著高于其他各组（图6D）;

此外，在Hepa 1 - 6肝癌模型中检测了抗SPP1和抗PD - 1联合治疗的效果。与在SPP1条件性敲除小鼠中的结果相似，在Hepa1 - 6荷瘤的免疫正常小鼠中，联合使用抗SPP1和抗 PD - 1治疗诱导了肿瘤生长的减少，与单独使用每种治疗相比显著提高了反应率（图6F）。抗SPP1和抗PD - 1联合治疗也显著增加了肿瘤区域Granzyme B⁺ CD8⁺ T细胞的数量（图6G-H）。研究还发现在SPP1条件性敲除或抗SPP1处理后，^αSMA ⁺成纤维细胞的表达降低。mIHC证明抗SPP1和抗PD - 1联合治疗显著降低了肿瘤区域^αSMA ⁺成纤维细胞的比例，并增加了CD8 ⁺ T细胞的比例（图6J）。说明SPP1可能是预测需要免疫疗法的HCC患者预后有价值的生物标志物，阻断SPP1有助于提高抗PD-1免疫疗法的疗效。

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图6

小结

总的来说，多重荧光免疫组化技术（mIHC）可实现在一张切片实现多个（7-9）靶标的标记，通过定量病理分析可获得组织细胞原位各种靶标类别、组分、表达量等信息，mIHC与单细胞测序、空间转录组等技术相结合，对于细胞亚型的空间定位、定性和定量等信息具有极大的优势，可被广泛应用于高通量测序技术的验证工作，其具备的深度数据整合的能力更能为文章无限增光添彩：

1、在空转中，mIHC可用于验证不同细胞亚型间的空间位置关系，以及与肿瘤的位置关系。此外，mIHC可用于验证细胞亚型在不同的组别间的密度与数目以及浸润情况的差异。
2、在单细胞中，mIHC可用于表征细胞类型表达的位置区域，以及不同的细胞亚型在不同组别中的比例。

阔然生物推出的一站式NGP肿瘤微环境检测方案，基于多重荧光免疫组化技术能够深入研究肿瘤免疫微环境，探索肿瘤微环境与肿瘤发生发展、复发、转移、耐药的关系，挖掘与肿瘤相关的预测性生物标志物，助力肿瘤病理诊断技术的进步。

参考文献

Liu, Yao et al. “Identification of a tumour immune barrier in the HCC microenvironment that determines the efficacy of immunotherapy.” Journal of hepatology vol. 78,4 (2023): 770-782. doi:10.1016/j.jhep.2023.01.011

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