奥希替尼是一种三代EGFR-TKI，可选择性抑制EGFR敏感突变和EGFR T790M突变，既往临床前研究还提示，奥希替尼有较好的血脑屏障穿透性，亦可穿透正常人的血脑屏障。III期FLAURA研究已经证明，奥希替尼相比一代吉非替尼或厄洛替尼一线治疗EGFR敏感突变阳性晚期NSCLC患者有显著的PFS获益，中位PFS分别为18.9个月和10.2个月，PFS HR=0.46（95% CI 0.37-0.57），亦有显著的OS获益，中位OS分别为38.6个月和31.8个月，OS HR=0.799（95.05% CI 0.641-0.997），还有显著的CNS PFS获益，中位CNS PFS分别为NR和13.9个月，CNS PFS HR=0.48，P=0.014。但无论奥希替尼一线治疗EGFR敏感突变阳性患者还是二线治疗T790M突变阳性患者，最终都会产生获得性耐药，目前已知的有EGFR依赖的或非依赖的多种耐药机制，包括EGFR G796/C797突变，L792突变，L718/G719突变，MET和HER2扩增，BRAF突变，KRAS突变，PIK3CA突变，FGFR3融合突变，RET融合突变，NTRK融合突变等。虽然掌握这些信息对研发克服EGFR-TKI耐药的治疗策略非常重要，但如何预防或者延缓获得性耐药也是另外一个非常值得努力的方向。既往针对PC9细胞系和异种移植瘤模型的研究提示，吉非替尼联合培美曲塞或吉非替尼间插培美曲塞或可预防或延缓耐药的发生，但也观察到一个有趣的现象，如果先给予吉非替尼后给予培美曲塞这种联合治疗方案似乎并不有效。理论上，因为化疗的广泛杀伤性，可有效限制肿瘤的异质性并延缓EGFR-TKI的耐药，最终起到改善治疗效果的作用。
细胞系简介
PC9是一种合并EGFR 19外显子缺失突变的非小细胞肺癌细胞系。将PC9亲代细胞暴露在浓度持续增加的吉非替尼中并诱导产生PC9T790M细胞克隆，将该细胞克隆暴露在1μM的吉非替尼中进行培养，使其在体外繁殖过程中保持选择压力。将PC9T790M细胞暴露在浓度持续增加的奥希替尼中，9个月后分离出对奥希替尼耐药的PC9T790M细胞克隆。
异种移植瘤模型构建简介
将总共5×106个PC9T790M细胞皮下注射给Balb/c-Nude雌性小鼠（n=8），当肿瘤平均体积达到150mm3时，给予奥希替尼治疗，每天一次，每周五次，经口灌胃，培美曲塞和顺铂以及对照药物经腹膜给予，每天一次，每周两次。
奥希替尼联合培美曲塞或顺铂对PC9T790M异种移植瘤模型和细胞系模型的有效性结果（二线治疗）
异种移植瘤模型构建完成后，将实验动物随机分成4个组，包括：对照组（ctrl）、奥希替尼单药组（osi）、奥希替尼间插培美曲塞（osi→pem）、奥希替尼联合培美曲塞间插奥希替尼单药（osi+pem→osi）。结果显示，osi组可抑制肿瘤生长50天，之后50%（n=4）的实验动物出现了获得性耐药；osi→pem组可抑制肿瘤生长30天，之后所有的肿瘤再次增大；osi+pem→osi组可抑制肿瘤生长110天，且在所有实验动物中均观察到肿瘤退缩，在这段时间里，实验动物并没有表现出毒性迹象，体重也经常增加。为了进一步检验肿瘤的根治效果，停止osi或osi+pem的治疗并观察肿瘤体积，osi组的4个小鼠肿瘤均快速复发，但在osi+pem组中没有观察到复发。
图1：奥希替尼联合培美曲塞治疗PC9T790M异种移植瘤模型的效果
研究还探索了基于顺铂的治疗对PC9T790M异种移植瘤模型的效果，使用同样的方法构建完异种移植瘤模型后将实验动物随机分成3个组，包括对照组（ctrl）、奥希替尼单药组（osi）、奥希替尼联合顺铂间插奥希替尼单药（osi+cis→osi）。结果显示，osi组可抑制肿瘤生长45天，之后50%的实验动物出现了获得性耐药；osi+cis→osi组可显著抑制肿瘤的生长，但与osi+pem→osi组不同的是，在osi+cis→osi组中观察到毒性迹象并导致治疗在78天后停止。有趣的是，osi+cis→osi组实验动物在治疗停止后均未出现肿瘤复发。
图2：奥希替尼联合顺铂治疗PC9T790M异种移植瘤模型的效果
在Masson三色染色切片上观察到，与仅用osi治疗的小鼠肿瘤相比，osi+pem和osi+cis可有效地将异种移植物的肿瘤成分减少2.79倍和3.42倍。肿瘤区域的缩小伴随着纤维化组织的一致增加，而坏死对联合治疗的效果没有显著影响。
图3：异种移植瘤的形态计量学分析，肿瘤组织为紫色部分，纤维化组织为绿色部分，黑线包围的属于肿瘤组织，不包括皮肤、附件和未受累的软组织
奥希替尼治疗进展后对所有肿瘤进行潜在的耐药机制探索。在一例奥希替尼耐药肿瘤中发现MET扩增和过表达，当没有在其他7例肿瘤中发现主要的获得性耐药机制。在所有耐药肿瘤中PC9T790M克隆均被保留，在其中6例肿瘤中出现新的FGFR3突变、FOXL2突变、GNAQ突变和H3F3A突变。
与既往吉非替尼联合培美曲塞的研究相似，在培美曲塞或顺铂之前给予奥希替尼的治疗方案对肿瘤细胞增殖的抑制效果较差，并且在与培美曲塞间插使用时可能产生互相拮抗的作用。反之，奥希替尼和培美曲塞或顺铂同步治疗时，可显著抑制肿瘤细胞的生长，在短期实验中，细胞死亡增长了60%。
图4：奥希替尼联合培美曲塞或顺铂的联合治疗方案对PC9T790M细胞系细胞增殖和细胞死亡的作用
奥希替尼联合培美曲塞或顺铂对PC9和HCC827细胞系细胞增殖和细胞死亡的作用（一线治疗）
使用PC9和HCC827这两个对合并EGFR突变且对第一代EGFR-TKI（如吉非替尼或厄洛替尼）敏感的细胞系进行体外实验。虽然没有使用异种移植瘤模型进行验证，但在细胞系研究中也观察到，对于初治患者，培美曲塞或顺铂可强化奥希替尼一线治疗的有效性。
图5：奥希替尼联合培美曲塞或顺铂对PC9和HCC827细胞系细胞增殖和细胞死亡的作用
本研究还进行了奥希替尼联合培美曲塞或顺铂对细胞内转导途径的调节和细胞死亡调节因子表达的影响分析。奥希替尼在PC9细胞系和PC9T790M细胞系中均有强效的EGFR、AKT和ERK激活抑制作用。此外，培美曲塞或顺铂不会影响这些蛋白的磷酸化状态，奥希替尼联合模式与奥希替尼单药模式没有差异。相反，联合治疗模式可强效的上调促凋亡的BCL-2家族成员Bim的表达，还可增强胱天蛋白酶7的激活和PARP的清除。
图6：奥希替尼联合培美曲塞或顺铂对PC9细胞系和PC9T790M细胞系信号传导通路和细胞死亡调节因子的影响
研究讨论
在一项随机评估吉非替尼同步或序贯联合卡铂和培美曲塞一项治疗的研究中观察到，吉非替尼同步化疗的方案有显著的PFS和OS获益，而吉非替尼序贯化疗的方案则展现出了拮抗作用并导致了较差的治疗结局。而在本研究中亦观察到，先给予奥希替尼后给予培美曲塞并不是一个好的治疗策略，而相反的，奥希替尼同步联合培美曲塞或顺铂可预防或至少可以延缓获得性耐药的出现，并且在治疗结束后还可持续抑制肿瘤的生长。我们没有在奥希替尼单药治疗中观察到这个现象，但也更有力的表明了，在抑制肿瘤生长或复发方面，增加化疗是可以强化奥希替尼疗效的。
研究总结
本研究为开展奥希替尼联合化疗对比奥希替尼单药一线治疗EGFR敏感突变阳性或二线治疗EGFR T790M突变阳性晚期NSCLC患者的相关随机对照研究提供了非常强有力的支持证据，尤其是奥希替尼联合培美曲塞或铂类对比奥希替尼单药的研究，这可能是显著延长EGFR突变阳性晚期NSCLC患者生存时间的“一大步”。
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