T细胞免疫功能障碍是慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的一个显著特征，也是免疫治疗失败和多药耐药的主要原因。目前仍缺乏特异性的生物标志物来评估CLL患者的T细胞免疫状态。T细胞因子1（TCF1）可作为抗肿瘤免疫治疗成功的关键决定因素和一些实体肿瘤的预后指标；然而，TCF1基因在CLL中的作用尚不清楚。
基于此，河南省肿瘤医院尹青松教授团队对TCF1基因在CLL中的预后价值及其共表达基因的生物学过程和功能进行了探索，以期为CLL患者的预后分层及未来免疫治疗方法选择提供参考。肿瘤资讯将该研究内容整理如下。
研究背景
CLL是一种异质性B细胞恶性肿瘤，是西方国家最常见的成人白血病。CLL细胞的存活依赖于肿瘤微环境，B细胞受体（BCR）信号通过CLL细胞和T细胞相互作用而被激活。T细胞是参与抗肿瘤免疫的主要效应细胞，既往研究表明CD4 +和CD8+ T细胞在CLL中富集。然而，CD4+ T细胞可以通过细胞因子分泌和直接接触刺激CLL细胞的存活和增殖，CD8+ T细胞在CLL微环境中持续受到刺激，最终失去效应功能，特别是在疾病进展过程中。功能衰竭是CLL患者对嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）治疗反应不佳的原因。然而，关于评估T细胞免疫状态的具体指标及其与CLL患者预后的相关性研究甚少。
TCF1是由TCF7基因编码的转录因子，其第1个由Notch信号诱导和激活的T细胞特异性转录因子，并且在T细胞成熟前一直保持高表达水平。激活的TCF1正向调控两个主要的靶基因BCL11B和GATA，从而维持T细胞的增殖。 此外，TCF1和BCL11B对于维持CD8+ T细胞的干细胞样特性至关重要。TCF1可促进CD8+ T细胞分化为TCF1+CD8+ T细胞，参与有效的抗肿瘤免疫。
研究方法
该研究对来自6个数据集的505例CLL患者的TCF1及BCL11B基因的表达对CLL患者的首次治疗时间（TTFT）、总生存期（OS）和限制平均生存时间（RMST）的影响，并对来自河南省肿瘤医院（HNCH）的50例CLL患者进行了验证。通过STRING数据库构建了共表达基因的蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络，并利用DAVID数据库对TCF7显著相关的共表达基因进行了KEGG通路和生物过程分析。
研究结果
CLL患者TCF1及基因表达显著降低
研究流程如图1，首先在GEO数据库和HNCH中心分别分析了CLL患者在PBMCs（外周血单个核细胞）、CLL细胞、T细胞和正常B细胞中的表达。在GSE66425数据集中，来自CLL患者的PBMCs中TCF1的表达量低于HIs（健康个体）（P=0.012；图2A）。虽然在GSE19147数据集中与HIs相比没有显著差异，CLL患者中TCF1+CD3+T细胞的比例有明显的下降趋势（P= 0.098；图2B）。来自HNCH的50例CLL患者中验证了上述结果。同样，qPCR结果显示，TCF1不仅在PBMCs中低表达（P = 0.011；图2C）。此外，流式细胞术（FCM）显示TCF1在CD3+的T细胞表达也较低（P=0.004；图2D）。因此，与HIs相比，TCF1在CLL患者的PBMCs中显著下调，特别是在CD3+T细胞中。
图1. 研究流程图。在GEO和STRING数据库中分析TCF1及其共表达基因的表达、生物学功能和影响。利用HNCH的50例CLL患者中验证上述研究结果。
图2. GSE66425 (A)和GSE19147 (B)数据集中CLL患者和健康个体（HIs）的PBMCs和CD3+T细胞中TCF1的表达。(C) qPCR和(D) FCM验证TCF1的表达结果。
TCF1表达降低预示着CLL患者TTFT和OS更短
大多数CLL患者在疾病早期无任何症状，直到出现治疗指征才开始接受治疗。TTFT是评估CLL患者疾病稳定性的重要指标。该研究使用GSE39671和GSE22762数据集，分析TCF1表达水平对CLL患者TTFT和OS的预测作用。结果显示，与TCF1高表达的CLL患者相比，TCF1低表达的CLL患者的TTFT（5年TTFT率： 36% vs. 57%，P = 0.009；图3E）和OS（5年OS率： 28% vs. 98%，P < 0.001；图3F）更短。在43例来自HNCH的CLL患者中证实了上述发现，并发现TCF1表达降低与TTFT缩短相关（5年TTFT率： 11% vs. 57%，P < 0.001；图3G）。此外，TCF1低表达的患者比TCF1高表达的患者的RMST更短（图3E-G，右侧图）。总的来说，TCF1低表达的患者疾病进展更快、生存时间更短。因此，TCF1可作为CLL患者的预后生物标志物。
图3. 不同数据集中TCF1高表达和低表达在CLL中的预后影响
TCF7共表达基因的PPI构建及14个hub基因的功能和KEGG通路分析
通过Venny过滤GSE39671（592个基因）和GSE22762数据集（903个基因）中共表达的114个基因，然后使用STRING数据库构建蛋白-蛋白网络。应用MCODE插件构建最重要的模块，选择得分最高的模块，包括TCF7、BCL11B、RUNX3、LCK、CD3E、LAT、AKT3、PIK3R1、CD86、IL10、FLT3LG、SLAMF1、CD7、CD244，这些基因被鉴定为潜在的枢纽基因，并通过Circos网络工具为绘制了14个枢纽基因的表达水平（图4A，右侧）。
KEGG通路分析结果显示14个hub基因主要参与T细胞受体信号转导和T细胞分化。值得注意的是，在PPI网络中的14个基因中，BCL11B、RUNX3、CD3E和LCK与TCF7基因直接相关（绿色突出显示）（图4B）。因此重建这5个基因的PPI网络（图4C）发现其主要参与T细胞活化、分化和T细胞受体重组的调控（图4C）。这些数据表明，TCF7与hub基因协同调节T细胞免疫。为了确定与TCF7密切相关的基因，该研究对这5个基因进行聚类后分为2个簇，分别为簇1（包括TCF7、RUNX3和BCL11B）和簇2（包括LCK和CD3E），其中簇1中的基因与TCF7密切相关（图4D）。通过qPCR进一步验证了BCL11B和RUNX3在CLL患者（HNCH）和HIs中的表达。结果发现，与HIs相比，CLL患者中BCL11B的表达显著降低（P = 0.008；图4E，左图），但RUNX3表达在CLL患者与HIs之间没有显著差异（P = 0.898，图4E，右图）。同样，与HIs数据中CD3+ T细胞上的BCL11B表达相比，CLL患者CD3+ T细胞上BCL11B表达显著降低（P = 0.044，图4F，左图），但RUNX3无显著差异（P = 0.550，图4F，右图）。此外，TCF7和BCL11B的表达水平高度正相关（GSE22762：R = 0.71，P < 0.001；GSE39671：R = 0.41，P < 0.001，图3G）。
图4. CLL患者TCF7共表达基因的生物学过程及KEGG通路分析及伙伴基因的筛选
BCL11B表达降低预示着CLL患者的TTFT和OS更短
为了研究BCL11B单独或联合TCF1对CLL患者预后的影响，该研究分别在GSE39671和GSE22762数据集中进一步分析了BCL11B对CLL患者TTFT和OS的影响。与高表达组相比，BCL11B的低表达与较短的TTFT和较差的OS显著相关（5年TTFT： 28% vs. 77%；5年OS：33%vs.98%）（图5A，B，左图）。同样，BCL11B低表达的患者的RMST比高表达的患者更短（图5A，B，右图）。上述结果在来自HNCH的50例CLL患者中得到了证实（5年TTFT：0%vs.28%）（图5C）。进一步分析BCL11B联合TCF1基因对预后的影响，发现与TCF1和BCL11同时高表达组相比，TCF1和BCL11同时低表达患者TTFT和OS（图5D，E，左图）以及RMST（图5D，E，右图）更短。其中，5年的TTFT分别为26%和74%，5年的OS分别为≤17%和100%。同样，这些结果也在HNCH中得到了验证。
图5. BCL11B单独或联合TCF1对CLL患者TTFT和OS的预测作用。
CLL患者TCF1表达与临床特征的相关性
为了探讨TCF1表达与CLL患者特征之间的相关性，该研究进一步整合了一系列临床特征，包括疾病状态、Rai分期、β2微球蛋白（β2M）水平、乳酸脱氢酶（LDH）水平、性别、年龄、淋巴细胞比例、IGHV突变状态、细胞遗传学异常，如del（17p）或P53突变(TP53畸变）、del（11q）、del（13q）和12号染色体三体、淋巴细胞绝对计数（ALC）和大肿块（≥5cm）（图6A-N）。结果发现TCF1表达降低与复发和难治性疾病显著相关（P = 0.001；图6A），Rai3-4期（P = 0.012；图6B）和β2M≥3.5（mg/L）（P = 0.009；图6C）主要作为疾病进展和不良预后的临床指标。Cox单因素分析显示≥65岁、女性、高β2M水平、高LDH水平、IGHV未突变、TP53畸变、del（11q）、12号染色体三体、Rai3-4期、复发/难治状态、低TCF1和低BCL11B是短TTFT的显著危险因素。在多变量分析中纳入具有统计学意义的TTFT因素（P < 0.05），发现IGHV未突变、TP53畸变、12号染色体三体、Rai3-4期、复发/难治状态、TCF1低表达和BCL11B低表达是TTFT缩短的独立危险因素。因此，TCF1是预测CLL患者疾病进展的潜在临床生物标志物。
图6. CLL患者TCF1表达降低与临床因素的相关性
表1. 与TTFT相关的危险因素的单因素和多因素Cox回归分析
CLL患者的CD3+、CD4+和CD8+ T细胞亚群中TCF1+细胞的百分比
为了探讨TCF1在不同T细胞亚组中表达降低的情况，该研究随后检测了33例CLL患者的CD3+、CD3+CD4+和CD3+CD8+ T细胞亚群中TCF1+细胞的百分比，并将其与HIs进行比较（图7A）。结果表明，CLL患者TCF1+细胞在CD3+，CD3+CD4+和CD3+CD8+ T细胞群的百分比明显低于HIs相应的T细胞亚群（P值分别为0.004，< 0.001和<0.001），尤其是在CD3+CD8+ T细胞群中（图7B，C）。值得注意的是，TCF1+细胞在CD3+CD8+T细胞群中的百分比明显低于CD3+CD4+ T细胞群，特别是在CLL患者中。这一结果提示CLL患者中TCF1+CD8+T细胞减少预示其T细胞免疫功能障碍。
图7. TCF1+细胞在CLL和HIs的不同T细胞亚群上的百分比
研究结论
本研究首次证实了TCF1和BCL11B表达降低与CLL患者的不良预后显著相关。TCF1基因共表达分析显示其与BCL11B基因表达呈正相关，主要参与调控T细胞的激活和分化。CLL患者中TCF1和BCL11B表达降低，特别是在CD8+ T细胞中可能使记忆CD8+T细胞的干细胞样分化潜能受损，导致T细胞免疫功能障碍，这可能是其导致CLL患者预后较差的原因。因此，基于TCF1和BCL11B对T细胞免疫的影响，有助于未来制定基于T细胞的免疫治疗的联合疗法。
Taotao Liang, Xiaojiao Wang, Yanyan Liu, Hao Ai, Qian Wang, Xianwei Wang, Xudong Wei, Yongping Song and Qingsong Yin. Decreased TCF1 and BCL11B expression predicts poor prognosis for patients with chronic lymphocytic leukemia. Front Immunol. 2022 Sep 23;13:985280. doi: 10.3389/fimmu.2022.985280. PMID: 36211334; PMCID: PMC9539190.
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