近期，发表在Journal of Clinical Oncology上一篇题为Gene Expression Signatures for the Accurate Diagnosis of Peripheral T-Cell Lymphoma Entities in the Routine Clinical Practice的文献，描述了一种将PTCL诊断特征转化为临床适用分析的方法，并实现了基于转录组学的PTCL分型，达到了与病理诊断高度一致的精准判定结果。该研究或可助力PTCL治疗领域相关研究及临床应用、使相关分型患者受益于靶向治疗。
研究背景
外周T细胞淋巴瘤（PTCL）约占非霍奇金淋巴瘤的10%-15%，但目前这一疾病的诊断和病理分型依然面临许多挑战。世卫组织分类识别了超过25种不同亚型的PTCL，比较常见的分类包括血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤（AITL），间变性大细胞淋巴瘤（ALCL），成人T细胞白血病/淋巴瘤（ATLL），以及结外NK/T细胞淋巴瘤，鼻型（ENKTCL）等。然而，仍有30%的PTCL无法被归为世卫组织标准的任何分类，被定义为PTCL-NOS。此外，与肿瘤相关的遗传异常，比如ALK基因易位导致的ALK阳性ALCL、感染噬T细胞病毒的ATLL、EB病毒（EBV）阳性的ENKTCL、IDH2突变的AITL等，在PTCL中也通常不常见。PTCL的预后通常较差，目前的治疗方案效果不佳，亟待优化；学界正在进行新型靶向治疗的相关探索，并取得了一些积极结果。
T细胞的生物学复杂性和功能可塑性，其能够衍生出众多不同的亚群。因此，与B细胞淋巴瘤相比，PTCL的亚型分类更具难度。在B细胞来源的非霍奇金性淋巴瘤中，基因表达谱（GEP）已经得到广泛应用，以描述患者的生物亚型、识别致癌途径。这一方法为PTCL的分类提供了参考，并在既往研究中成功确定了PTCL-NOS的两个生物学和预后亚组（PTCL-GATA3和PTCLTBX21）。
然而，这些研究是在新鲜冷冻（FF）样本上进行的，具有全转录组阵列，限制了其在常规临床实践中的应用。临床上，福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的病理组织样本被广泛用于常规诊断，但福尔马林固定会导致组织样本的RNA和DNA片段化、交联或发生化学修饰。基于FFPE样本的RNA检测难度很大，但对临床上PTCL的特征诊断而言是有必要的。
本研究通过将RNA数字量化，把PTCL的诊断特征整合到技术平台中，用于对PTCL分类的准确诊断。研究分为一个训练（n=105）队列和一个独立验证（n=140）队列，在单一平台上对PTCL进行亚组分类。为了提高诊断的准确性，该研究还添加了几种病毒转录本以提高诊断的准确性。最终，该研究报告了一种诊断算法，该算法在区分PTCL类型方面达到了较高的敏感性、特异性和准确性，包括前述的新分子生物学亚型PTCL-GATA3和PTCLTBX21。
研究方法
研究纳入了249例来自多个机构的PTCL患者，在排除4例RNA质量较差的病例后，将其余患者分为一个训练队列（105例）和一个验证队列（140例），前者包含先前生成的FF样本和FFPE样本的GEP信息，后者此前未被分析。3名血液病理学家对入组的PTCL病例进行了集中审查，并根据目前的WHO分类作出诊断。训练队列既往生成的GEP数据及其相匹配的FFPE组织，被纳入nCounter平台用于分类基因的选择。数据分析和归一化设计为单独处理样本，而非批量处理，因此该方案将适合应用于处理患者样本。
训练列队和验证列队的临床病理特征基本一致，两组在性别、年龄和总生存期（OS）存在一定的差异。存活患者的中位随访时间为3.5年（范围：0.01年~24年）。ALK1 ALCL病例的预后优于其他类型，这与既往发表的研究一致。
研究结果
基于HG-U133 plus 2.0（Affymetrix，Inc，Santa Clara，CA）和nCounter两种平台对于样本的转录组信息进行评估，发现特定基因与分型的高相关性（相关系数r＞0.4）。使用Pearson相关性进行递归过滤分析，排除了相关系数为≤0.4的转录本，每个PTCL亚型生成11-20个诊断转录本和16个管家基因。无论是训练队列中的FF RNA还是相对应的FFPE RNA，通过nCounter平台评估，这些表现良好的转录本不影响分类的准确性、敏感性和特异性。使用FFPE样本进行分子分类与基于FF样本、按照金标准分类的结果高度相似，不同PTCL亚型的错误率为5%。
为了评估诊断性能，将nCounter平台获得的分子分类与独立验证队列中一致的病理诊断进行比较。nCounter平台获得的分类与专家病理学家提供的诊断具有高度的可比性，在验证病例中总体一致性为91%（140例中有127例，95% CI：0.85 ~ 0.95），并进一步细化了PTCL病例的分类，具体如下：
AITL
与泛T-FH基因表达显著相关。nCounter在训练和验证队列中均验证了具有共同相关免疫形态特征的AITL。在训练队列中有83%的一致性（24例中有20例），在验证队列中有74%的一致性（19例中有14例）；而其余病例则显示了AITL和PTCL-NOS之间的临界模型。这些病例在基于阈值或截断点的诊断中被遗漏，经复查证实为典型AITL免疫形态特征。突变分析支持诊断，典型AITL突变谱包括TET2、DNMT3A 、RHOAG17V、IDH2R172；测序数据中有89%的病例出现AITL突变谱。
ALCL
分析显示，nCounter在训练和验证队列中均验证了具有共同相关免疫形态特征ALCL。训练队列的ALCL病例有83%的一致性（36例中有30例），验证队列有74%的一致性（29例中有26例）。按ALK状态分类的ALCL病例显示，ALK1 ALCL病例OS较好。2例具有低ALCL特征的ALK2 ALCL病例不表达CD30 mRNA，无法对这些病例进行分类可能是由于RNA质量不佳或肿瘤含量低；这些发现也表明，偶尔的低诊断特征的病例应谨慎诊断。
ATLL
同样的，nCounter在训练和验证队列中均实现了ATLL分型的验证。训练队列的一致性为100%的ATLL病例（7例全部），验证队列的一致性为83%（12例中有10例）。出现分歧的两例ATLL诊断标志呈边缘表达，但均证实为HTLV1 mRNA表达阳性。在两个HTLV1转录本（HBZ和Tax-1）中，与Tax-1相比，HBZ在ATLL病例中始终保持较高水平的表达，并与ATLL标志呈正相关，qRT-PCR检测结果与HBZ表达显著相关。验证队列中有2例PTCL-NOS病例被分子分类为ATLL，使用HBZ特异性qRT-PCR重新评估这些病例，证实了HBZ的表达，被重新归类为ATLL。
ENKTCL
分类模型能够识别训练队列90%（10例中有9例）和验证组95%（21例中有22例）的ENKTCL病例。与其他病例相比，部分病例出现了CD3g和CD3d的表达升高，可能来源于T淋巴细胞系。2例此前根据现行WHO分类，被诊断为原发性EBV阳性淋巴结T/NK细胞淋巴瘤。这些病例与ENKTCL相似，均经分子分析重新归类为ENKTCL。
两种新型PTCL-NOS亚型（PTCL-GATA3和PTCL-TBX21）的验证
针对PTCL-NOS病例，两种新亚型的区分实现了87%的一致性。通过nCounter平台分析，其余的52例PTCL-NOS病例中，40%（21例）被归为PTCL GATA3亚型，52%（27例）归为PTCL-TBX21亚型。该分类与免疫组化分类具有良好的一致性（总体一致性达到80%）。为了进一步验证转录组标志物，研究比较了这两组患者的测序数据，观察到TET2突变等基因改变在PTCL-TBX21亚型中频繁出现，而TP53突变在PTCL-GATA3亚型中富集，这与既往发表的研究结果一致。PTCL-TBX21亚型有更显著的细胞毒转录表达，且通常具有丰富的炎症背景。相对而言，PTCL-GATA3的OS比PTCL-TBX21的更低（中位OS：0.57年 vs 1.4年）。
研究讨论
PTCL的诊断是最具挑战性的淋巴瘤之一，其病理分型难以确定，往往导致误判。同时，PTCL目前的临床治疗手段有限，效果不佳。近年来，诸如维布妥昔单抗等靶向治疗的出现已经改善PTCL的治疗，但需通过对患者更加精准的诊断和分型，才能保障并提升靶向治疗的作用。
该研究对PTCL进行了广泛的GEP研究，构建了基于RNA的分子诊断特征和生存预测因子，并描述了关键的致癌机制。研究使用nCounter平台进行了系统分析，以识别入组患者FFPE组织中的RNA，该平台的识别结果与基于FF组织的GEP数据具有良好的相关性；训练队列与验证队列的结果非常相似，说明nCounter平台的判定保持了较高的敏感性、特异性和准确性。这种数字定量技术能够耐受FFPE样本制作过程造成的RNA降解，提供可信度很高的检测结果。
此外，使用RNA storm kit等技术进行改良后，FFPE组织也可分离出高产粮、高质量的RNA，利于提升检测精准度。该研究还开发了一种诊断性转录组签名，该签名通过少量的转录本进行判定，其在训练队列中的表现与既往基于GEP产生的诊断相当。
总之，本研究所描述的将PTCL诊断特征转化为临床适用分析的方法，有望为PTCL领域普通和学术病理研究的有用工具。未来，该分析方法或可促进PTCL细化其定义，并确保临床试验的队列分层更加统一。PTCL的分类依然是一个不断发展的领域，随着人们对基础生物学和可用技术的进一步理解和提高，这一系统将进行修改和完善，使分类方法更加精准、具有临床相关性。
Amador C，Bouska A，Wright G，Weisenburger DD，Feldman AL，Greiner TC，Lone W，Heavican T，Smith L，Pileri S，Tabanelli V，Ott G，Rosenwald A，Savage KJ，Slack G，Kim WS，Hyeh Y，Li Y，Dong G，Song J，Ondrejka S，Cook JR，Barrionuevo C，Lim ST，Ong CK，Chapman J，Inghirami G，Raess PW，Bhagavathi S，Gould C，Blombery P，Jaffe E，Morris SW，Rimsza LM，Vose JM，Staudt L，Chan WC，Iqbal J. Gene Expression Signatures for the Accurate Diagnosis of Peripheral T-Cell Lymphoma Entities in the Routine Clinical Practice. J Clin Oncol. 2022 Jul 15：JCO2102707. doi：10.1200/JCO.21.02707. Epub ahead of print. PMID：35839444.
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