天津医科大学肿瘤医院淋巴瘤科张会来教授团队长期致力于恶性淋巴瘤临床与转化相关研究，近几年，该团队先后在Blood、JEM、JITC、AJH等国际知名杂志发表论文。2022年7月14日该团队再次在血液肿瘤领域权威期刊Leukemia（IF=12.883）上发表了题目为“APR-246 triggers ferritinophagy and ferroptosis of diffuse large B-cell lymphoma cells with distinct TP53 mutations”的研究成果，该研究整合了全外显子测序、靶向深度测序等数据，并从细胞、动物和分子层面，全面揭示了DLBCL中不同TP53突变类型对患者预后的影响，探究了APR-246诱导不同TP53突变型DLBCL细胞发生铁死亡和铁自噬的新型机制。
研究者通过整合自己团队及来自全球多个中心的DLBCL全外显子测序、靶向深度测序数据，共纳入2464例DLBCL患者进行TP53突变类型的综合分析。结果发现，约16%的患者伴有TP53突变，TP53单点错义突变率高达71%，发生在DNA结合域（DBD）的突变率约为89%。其中127例患者突变位点为既往报道的TP53热点突变位点，包括R175、R196、R213、G245、R248、R273和R282，这与实体瘤相似。此外，N239突变在DLBCL中体现更高频率。
Figure 1. DLBCL中TP53突变研究流程图
研究发现，TP53突变对所有DLBCL患者具有更差OS（p=0.0207）；根据细胞起源分类，这种预后不良更多体现在GCB和UNC亚型（p=0066；p=0.0179）。值得注意的是，位于DBD（5-8号外显子）的TP53单点突变方能导致患者不良预后（p=0.0009），而携带TP53多点突变和其他结构域单点突变的患者在生存上与携带野生型TP53的患者没有显著差异。
Figure 2. DLBCL中TP53突变和预后影响
进而，研究者对不同外显子进行了逐一分析，并发现7号外显子发生TP53突变将导致患者发生不良OS（p=0.033），而5和6号外显子发生TP53突变将使患者具有更差PFS（p=0.0446；p=0.0061）。与TP53 野生型患者相比，其他外显子的TP53突变没有体现出显著的预后价值。
Table 1. 根据TP53突变状态分类的2464例DLBCL患者临床特征
此外，在DLBCL整合队列（N=2464）中，TP53突变在GCB亚型中发生的频率高于其他亚型（p=0.031224）。
Figure 3. TMUCIH队列TP53 WT/MUT亚群中DLBCL相关的关键基因突变
该研究还发现，TP53 突变DLBCL患者中最常见发生遗传改变的基因（>15%）包括表观遗传调节因子（KMT2D）、细胞周期（PIM1）、Notch通路（DTX1）、NF-κB通路（TBL1XR1和TNFAIP3）和免疫调节通路（TNFRSF14）等重要关键基因。值得注意的是，编码参与T细胞和自然杀伤细胞介导反应的分子CD58基因在TP53 MUT亚组中的突变频率显著低于TP53 WT亚组（2% vs 11%，p<0.05），但两个亚组间肿瘤突变负荷没有差异。这提示突变的TP53具有相对独立的功能，是改善DLBCL患者预后的一个重要着入点。
Figure 4. APR-246在体外和体内抑制DLBCL细胞增殖
APR-246又被称为Eprenetapopt或 PRIMA-1MET，是针对TP53突变设计的靶向药物。然而，随着研究愈深入，发现APR-246作用机制多样化，可从多个分子层面发挥不同的作用。该研究在细胞水平发现，APR-246可以剂量依赖性方式诱导所有DLBCL细胞发生死亡。TP53 DBD段发生错义突变的DLBCL细胞对APR-246敏感性高于TP53野生型或其他类型突变的DLBCL细胞。在小鼠皮下成瘤模型中发现，APR-246 亦可在体内以剂量依赖性方式抑制DLBCL肿瘤生长，证实了APR-246在体内也可诱导TP53突变的DLBCL细胞死亡。
Figure 5. APR-246诱导不同TP53突变型DLBCL细胞发生不同方式细胞死亡
研究者选取5株伴或不伴TP53突变的DLBCL细胞系进行进一步的研究，加入不同细胞死亡方式的抑制剂Fer-1 (10 µM), DFO (150 µM), Nec-1 (20 µM), NES (1μM), CQ (20 µM) 或 QVD-OPH (20 µM)预处理2h后，再加入APR-246 24h后检测细胞活性，发现伴7号外显子突变的OCI-LY7中加入铁死亡及自噬抑制剂后能够抑制细胞死亡，而其余细胞仅观察到铁死亡抑制剂起效。
Figure 6. APR-246诱导不同TP53突变型DLBCL细胞产生ROS和发生胞膜脂质过氧化作用
与此同时，研究者选取伴或不伴TP53突变的OCI-LY7、OCI-LY3、TMD8细胞系，加入ROS抑制剂NAC(5mM)预处理2h后加入APR-246 24h后检测细胞活性，结果表明APR-246诱导的DLBCL细胞死亡涉及ROS的产生。而在OCI-LY7、OCI-LY3、TMD8和OCI-LY7 TP53-KO细胞中加入Fer-1 (10 µM), CQ (20 µM) 预处理2h后再加入APR-246 处理24h，检测H2-DCFDA阳性细胞及BODIPY-C11阳性细胞，发现在OCI-LY7中Fer-1和CQ均能恢复加入APR-246处理后细胞膜上发生的脂质过氧化。
Figure 7. APR-246诱导TP53第7号外显子单点错义突变的DLBCL细胞发生TP53依赖性铁自噬
研究者进一步发现，对于TP53在DBD发生错义突变的DLBCL细胞，APR-246通过TP53依赖性铁自噬介导细胞死亡。此外，APR-246还诱导含有野生型TP53和其他形式TP53突变的DLBCL细胞发生铁死亡。
目前为止，本研究是全球最大样本量系统研究不同TP53突变类型对DLBCL预后的影响，并明确了具体突变形式在DLBCL预后中的意义。通过探究针对p53突变体的小分子化合物APR-246在DLBCL中的作用，本研究揭示了诱导DLBCL细胞发生非凋亡的细胞死亡可能是DLBCL的一个新靶点。该结论一则丰富了APR-246诱导肿瘤细胞早期死亡（作用24小时）的新型机制，推动了APR-246用于克服高危人群TP53突变DLBCL患者不良预后的应用；二则为TP53突变DLBCL患者亦提供了新的治疗潜在靶点。
英国期刊Leukemia杂志由Nature Publishing Group出版，今年影响因子IF为12.883。Leukemia杂志JCR分区：肿瘤学1区、血液学1区；中科院2021年12月最新升级版SCI期刊分区：肿瘤学1区、血液学1区。
天津医科大学肿瘤医院淋巴瘤科2019级硕士研究生洪宇桁、2018级硕士研究生任天元和2019级博士研究生王晓璇为该论文的并列第一作者；张会来教授和王先火教授为该论文的共同通讯作者。该研究项目得到国家自然科学基金委、天津市自然科学基金委等的资助以及天津医科大学肿瘤医院国家恶性肿瘤临床医学研究中心的大力支持。
张会来教授简介
天津医科大学肿瘤医院淋巴瘤内科主任，肿瘤学博士，主任医师，博士研究生导师，肿瘤医院临床I级PI，中国抗癌协会淋巴瘤专业委员会副主任委员，中国临床肿瘤学会淋巴瘤专家委员会常委，中华医学会肿瘤分会淋巴瘤学组委员，天津市抗癌协会肿瘤临床化疗专委会主任委员，天津市血液病质控中心副主任委员，天津市医师协会血液医师分会副会长。《肿瘤药学》副主编、《中华血液学杂志》、 《白血病∙淋巴瘤》、《中国肿瘤临床》、《Hematological Oncology》、《Discover Oncology》等国内外期刊杂志编委, 以第一或通讯作者在Blood、J Exp Med、Leukemia、JITC、CTM、AJH 、BJH、 Blood Adv、Int J Cancer 等国内外专业杂志发表论著七十余篇。获天津市科技进步二等奖1项及三等奖3项。
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