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弥漫大B细胞淋巴瘤分子分型进展与预后价值
苏丽萍教授：尊敬的各位同道，大家好！欢迎大家走进淋巴瘤微课。
弥漫大B细胞淋巴瘤是一种高度异质性的淋巴瘤的亚型，大家都认为它是一种疾病、一个诊断、是众多疾病的特点。同为弥漫大B细胞淋巴瘤，但它的细胞来源不同、分子生物学特征不同、治疗反应也不同、预后也不同。
WHO淋巴造血系统肿瘤DLBCL病理分型演变
接下来我首先给大家谈一下WHO关于淋巴系统疾病的病理分型的演变过程，在2016年版的WHO淋巴瘤的诊断标准当中，它结合了细胞遗传学和分子生物学的特征，把一部分高级别的大B细胞淋巴瘤分出来，把DHL（双打击型淋巴瘤）、THL（三打击型淋巴瘤）这部分类型分出来，同时也根据GEP分型的方法将弥漫大B细胞淋巴瘤分为生发中心来源和活化B细胞型。从GCB和ABC型当中发现了两种亚型不同的预后在一定层面上解释了弥漫大B细胞淋巴瘤的异质性。
我从以下两个方面来分享今天的内容：第一，从基因表达谱GEP来谈弥漫大B细胞淋巴瘤分子分型。第二、基于高通道测序的分子分型。2000年在Nature杂志上发表这篇文章可以说是一个里程碑式的变化，它采用分子分型的方法将弥漫大B细胞淋巴瘤分为GCB跟ABC型。进一步的发现这两种不同的亚型的预后是不一样的，同时它也跟IPI的相关性做了分析，比如同为IPI高危组或者同为IPI低危组的病人，如果它是GCB混到ABC型的不同的亚型那么它的预后也是不完全一样的，所以分子分型对预后判断有很重要的价值。
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在2002年新英格兰杂志也发表一篇文章它是对240名弥漫大B细胞淋巴瘤患者的活检标本，采用基因组分型的方法进行分析。同时也跟IPI的进行了比较，将弥漫大B细胞淋巴瘤分为GCB、ABC、第三类不能分型的亚型。在这三个分子分型当中，GCB型是预后最好的而ABC和不能分型第三类预后相对比较差，GEP的分型的方法由于技术的限制，近几十年来临床真实世界当中，大家多采用的还是免疫组化的方法来进行弥漫大B细胞淋巴瘤的不同亚型的分型，比如大家最常用的HANS分型法，它就是采用三个免疫组化对标志物CD10、BCL6以及MUM1将弥漫大B细胞淋巴瘤得分为GCB跟Non-GCB这两种不同类型的，预后也是不一样的，有明显的差异。同时HANS分型法也跟GEP基因标准的方法做了一致性的分析，结果显示对于GCB来讲，它的一致性是71%。对于ABC型来讲，它的一致性是88%。
在2009年的时候，Clin Cancer Res也发表了一篇文章Chois团队它采用CD10、MUM1、BCL6 GCET1、FOXP1这五个免疫组化的表型将弥漫大B细胞淋巴瘤分为GCB跟ABC型。这个团队拿这部分标本同HANS分型法、GEP方法分别做了比较，Chois分型方法与金标准GEP方法一致性是高达93%，而HENS分型法跟金标准GEP的分型一致性是86%。这个临床研究显示，用免疫组化的HANS法或者Chois方法也可以部分替代金标准的GEP方法，一致率还是比较高的。但是Chois方法比HANS分析法略有优势。我们也看到它们跟金标准的GEP的方法做了EFS和OS比较，两者基本上是有高度的一致性，无论是Chois还是HANS。
新型技术——NanoString方法解读
接下来我们看一下NanoString的方法，也是近年来一个新型的技术， 2014年Blood杂志上发表一篇文章，这个检测系统就是我们称之为Lymph2Cx检测的分析系统，是基于福尔马林固定石蜡包埋组织对于20个基因表达的COO的分型采用NanoString的方法进行检测的。同样它也可以把弥漫大B细胞淋巴瘤分为GCB、ABC和不能分型的第三类，同时它也跟金标准的GEP方法、传统的免疫组化的HANS、TALLY和CHIOS方法进行了比较，一致率也是很高的。我们看到它远期的疗效OS、PFS跟金标准的GEP方法几乎是完全一致的，明显的要优于我们HANS、CHIOS、TALLY的方法。接下来这个团队在2018年又发表一篇文章，同样是在Blood杂志上，它采用Lymph3Cx这样的方法，基于58个基因表达的检测法通过石蜡包埋来进行弥漫大B细胞淋巴瘤的分型，不仅仅分出GCB、ABC还有不能分型，同时把原发纵隔弥漫大B细胞淋巴瘤也分出来，同样也跟梅奥还有BCC两个团队进行了验证，同时也跟传统的免疫组化的方法和金标准GEP的方法做了比较，也具有高度的一致性。Lymph3Cx虽然比较不错，但是在我们国家还没有推广开来。今年晓丘主任在Front Oncol发了一篇文章，是基于qPCR平台采用32个基因来对弥漫大B细胞淋巴瘤进行了COO的分析，我们看到这个结果就是159例弥漫大B细胞淋巴瘤根据这32个基因表达谱进行分型，把弥漫大B细胞淋巴瘤精准的分为GCB、ABC两个亚型，同时跟金标准的GEP方法做了比较，一致率高达92%。而同期做的免疫组化与金标准来比较的一致率仅仅是77%。qPCR平台检测的方法在临床上有高度的实用性。目前在我们国家很多中心已经应用这个方法进行弥漫大B细胞淋巴瘤的分子分型。
接下来就介绍一下基于高通量测序的分子分型，弥漫大B细胞淋巴瘤无论是GCP、ABC或者是不能分型的第三类或者原发纵隔大B细胞淋巴瘤，每一个不同的亚型当中都有它特征性的分子的Mark，比如GCB型，高表达就是BCL2、EZH2、BCL6、MYC等等。在ABC当中表达的是MYD88，BCL2、CD79B还有CARD11等等。原发纵隔最多见的还是PDL1、JAK2，不能分型当中可能是BCL6 Tx或者是其它。总体来说，对于弥漫大B细胞淋巴瘤的四个分子亚型的分子Mark表述。
另外一个研究就是2016年的Clin Cancer Res这篇文章上，研究也基本上证实这四个不同的分子亚型，它们所具有的分子Mark基本上是一致的。ABC型大多数是NF-kappaB通道上的异常，而GCB型主要是表观遗传学方面的异常，而原发纵隔大B主要是JAK-STAT通路上的异常对于病人来讲，如果没有明确分子分型的特点，可以应用这样的思路去帮助病人选择靶向治疗的药物或者靶向治疗的选择。
2018年在新英格兰杂志发表了分子分型“4分类”，对574例弥漫大B细胞淋巴瘤的标本通过外显子的测序，基于基因芯片的DNA拷贝数分型方法分析了372个基因。根据这372个基因检测的结果分出来四个分子亚型， MCD型、N1型、BN2型和EZB型。MCD型主要是MYD88和CD79B的高表达，而N1型就是NOTCH1的表达，BN2型就是BCL6和NOTCH2的表达，EZB型就是BCL2跟EZH2的表达。根据不同的细胞遗传学的分子表达分出来四个分子亚型。”4分类”的分子亚型，我们有一个相对比较深刻的了解。目前来讲，只有不到一半的弥漫大B细胞淋巴瘤的患者可以拿它来做出一个相对比较精准的分子分型，还有一半的病人是不能够拿它做出分型。它解决了一部分病人异质性的情况，但是仍然遗留了一部分的病人不能够拿它去分类。”4分类”重要的价值还在于它对预后的判断价值。“4分类”的分型整体来看EZB型、BN2型相对比较好，而MCD型跟N1型是比较差的。在GCB型跟ABC型当中，为什么疗效有差异？根据“4分类”可以在这方面做出更进一步的结果，GCB当中分子分型是EZB的，那么它在GCB当中相对预后比较差的。在ABC当中，我们看到预后都是比较差的，但是在它当中还有相对比较好的就是BN2型。所以分子分型的特征也解决了ABC跟GCB这两类不同分型的异质性。
接下来我们再看一下2020年Cancer Cell杂志上发表了这篇文章，将弥漫大B细胞淋巴瘤分为“7分类”，实际上是前面”4分类”的衍生，在”4分类”当中有些基因没有纳入进去。第二，将近一半的病人没有依靠“4分类”来进行分型，它额外加了一些基因，比如TP53还有MYC等等。最后将这部分病人分为“7分类”，MCD型、N1型、A53型、BN2型、ST2型、MYC。EZB中又分为MYC+和MYC-这样两个类型，通过 “7分类”，把患者又分为七个分子亚型。MCD型是同样的，BN2型也基本上同样的，EZB型的分MYC+和MYC-，ST2型又分为SGK1和TET2突变的，A53型就是TP53不良的预后因素，N1型是跟之前一样的。“7分类”能够使将近70%的病人可以通过这个来进行分型，只剩30%多的病人还是不能够通过这个分子分型来进行分类。它在分子分型当中更加的细化，另外囊括的病人的数量也增加，而且我们看到不同的亚型当中它还有一些靶向药物供我们选择。“7分类”是通过三个大的中心NCI、Harvard还有BCC进行了验证。“7分类”也有它的预后的价值，它的OS、PFS也是有不同的预后价值。
接下来我们就谈一下2018年Nature Medicine上发表的弥漫大B细胞淋巴瘤“5分类”的分子分型，它是对304个初诊的弥漫大B细胞淋巴瘤通过外显子靶向DNA测序进行检测分析，最后分为C1~C5型，C0实际上是没有细胞遗传学与分子生物学变化。这五个类型同样也是具有不同的预后价值，C1、C4型是相对预后良好的，C2型是预后不确定的，C3、C5型是预后比较差的。COO分型当中，我们看到它跟分子Mark的相关性。C5型是预后不良的ABC型这一类型的预后相对比较差，预后不良容易侵犯中枢，也容易侵犯睾丸，它主要是MYD88、CD79B容易出现突变，所以在治疗选择上选择BTK抑制剂可能会比较好。C1型它是一个预后良好的ABC型，从这个上面可以看到同样是ABC型患者如果他是C5型预后就不好，如果他是C1型预后相对良好，就解释了为什么同一个亚型它的预后不同。这个就是分子学分型重要的一个方面，它从分子的角度诠释了弥漫大B细胞淋巴瘤的异质性。C1型大多数可能是有意逆行的边缘区转化而来的，C3型就是预后不良的GCB型，GCB型都是相对预后好的，为什么有些病人会预后不好？如果它的分子分型是C3型的就可以解释它是在GCB中预后比较差的，大多数的基因表达是表观遗传学方面，比如EZH2等等。C4型也是预后良好的GCB型的，另外还有C2型，因为它伴有很多的基因的不稳定，所以它现在的预后判断还不太明显。所以无论是“4分类”“5分类””7分类”，它从分子学的角度解释了弥漫大B细胞另外一个层面的异质性，让我们可以把同样是GCB型的或者ABC型的病人在重新分组分层。另外 “4分类”“7分类”跟“5分类”有一些是重叠的，跟COO分型也有一些是有密切相关性的。
结语
最后对内容进行小结，GEP是COO分型的基因标准，但是由于技术和费用的限制很难应用到临床，所以这么多年来我们大家所应用都是免疫组化的HANS、CHOIS或者TALLY，同样也是由于技术的发展我们现在可以用一些比较简便的分子分型进行弥漫大B细胞淋巴瘤的分子学的分型，Nanostring方法在国际国内都享有很高的声誉，但是在我们国内目前还没有广泛推广开来，我们国人就是上海复旦李晓丘教授的基于qPCR基础上的分子分型。从技术角度来讲，能够很快在我们国内能够推广开来，而且跟基因标准的GEP分型方法一致率也是非常高的，基于NGS强大的技术功能状态，它可以分型基因突变、基因拷贝数的变异、染色体结构异常以及基因表达等等。目前已经广泛应用于弥漫大B细胞淋巴瘤的临床实践。在弥漫大B细胞淋巴瘤的分型、预后判断、残留病灶的监测、治疗反应的监测、提供靶点的治疗等等方面已经发挥了重要的作用，所以弥漫大B细胞淋巴瘤的分子分型具有很大的很好的应用前景。
感谢各位同道收看今天的淋巴瘤微课，谢谢大家！
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