BRAF+最前沿月评(原“黑色素瘤文献月评项目”) 项目秉承传递最新医学进展的理念，以专业视角多维度关注领域最新进展。本期精选了BRAFi+MEKi连续剂量与间歇剂量疗效和安全性对比、探索达拉非尼联合曲美替尼再联合PD-1/PD-L1方案等内容，特别邀请复旦大学附属肿瘤医院肿瘤内科刘欣教授为我们带来深入解读。
复旦大学附属肿瘤医院肿瘤内科 副主任医师
CSCO黑色素瘤专家委员会委员
CSCO黑色素瘤青年专家委员会委员
中国抗癌协会多原发和不明原发肿瘤专委会委员
上海市抗癌协会肉瘤专业委员会委员
上海市抗癌协会疑难肿瘤专业委员会委员
上海市抗癌协会黑色素瘤专业委员会委员
主持国家自然科学基金等课题，曾获得教育部科技进步奖二等奖、上海市医学科技奖三等奖、中国抗癌协会科技奖三等奖等
复旦大学附属肿瘤医院“十大医务青年”、优秀主治医师、优秀住院医师
美国Mayo Clinic访问学者
1. BRAF+MEK位点间歇抑制方案在黑色素瘤治疗中获益不佳 [IF=26.370]
2. PD-L1单抗联合抑制MAPK原癌基因信号通路在进展期黑色素瘤中的探索 [IF=11.878]
3. KEYNOTE-022第3部分：帕博利珠单抗、达拉非尼和曲美替尼治疗BRAF突变黑色素瘤的随机、双盲II期研究 [IF=8.676]
4. 循环肿瘤DNA（ctDNA）对接受系统治疗的黑色素瘤患者预后的影响 [IF=6.162]
5. BRAF作为阳性预测生物标志物：关注肺癌和黑色素瘤患者 [IF=5.012]
1. BRAF+MEK位点间歇抑制方案在黑色素瘤治疗中获益不佳
背景：BRAF联合MEK位点持续抑制的治疗方案极大地改善了BRAF V600突变患者的治疗结局，客观有效率高达70%；然而，获得性耐药却普遍存在。近期的临床前模型实验表明，间歇给药方案可以延迟药物敏感性丧失。在小鼠模型研究中，其结果提示间歇给药可以延长无进展生存期（PFS）。
研究概况：Algazi团队启动了一项随机、开放标签II期临床试验，入组206例转移性或不可切除黑色素瘤BRAF V600突变患者进行BRAF抑制剂达拉非尼联合MEK抑制剂曲美替尼治疗。105例患者随机入组接受连续治疗方案，其余101例患者随机入组接受间歇剂量（用药5周后停药3周，8周为一个循环）。其结果与临床前数据的预期结果相反，间歇给药方案PFS不佳，连续给药组中位PFS为9.0个月，间歇给药组中位PFS仅为5.5个月。试验结果中的两组总生存期（OS）无显著差异，中位OS均为29.2个月。此外，间歇性给药计划并没有减少药物相关毒性。
结论：该试验表明，目前使用的BRAF抑制剂联合MEK抑制剂应采用连续给药方案。并应注意在采用新的治疗方案之前，临床前数据必须在人体试验中得到验证。
本文是由Cancer Discovery编辑部所撰写的研究观察，该研究全文于2020年10月发表于Nature Medicine. [Nat Med. 2020. 26, 1564–1568.]
图1 研究设计
图2 连续与间歇给药的PFS（左）及OS（右）的Kaplan-Meier图（a）及森林图（b）
BRAF和MEK抑制剂的联合、连续给药显著改善了BRAF突变晚期黑色素瘤患者的预后。联合给药的ORR为60%~70%，中位PFS为11~12个月。然而，继发性耐药一直是制约靶向治疗疗效的一个因素。临床前研究发现，间断给药可以延缓耐药克隆的出现，在老鼠模型中可以延长PFS。Algazi等的随机对照II期临床研究进一步探索了这种给药策略。然而结果显示，BRAF和MEK抑制剂的间断给药与连续给药相比，中位PFS时间更短（分别为5.5个月和9个月），这没有复制出临床前研究的结果。并且，令人意外的是，间断给药和连续给药相比，并没有降低药物相关的毒性。这项研究提示，对于BRAF和MEK抑制剂的用药，还是应该连续给药。也警告我们对于临床前研究的结果，应该审慎对待，需要进一步在临床研究中确认。间断给药失败的可能原因有：不同患者有不同的耐药机制和异质性，固定的间断给药方案不适合所有患者；老鼠模型不能反映人体肿瘤和耐药的异质性；曲美替尼的半衰期长达4~5 天，这种间断给药模式可能不能使信号调节激酶（ERK）表达回调等。对于BRAF抑制剂的继发性耐药机制和克服耐药的策略还需要进一步研究，包括促癌丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的再激活、BRAF特异性的改变、其他RAF蛋白的过表达、替代通路的激活、细胞周期调节的改变等。
2. PD-L1单抗联合抑制MAPK原癌基因信号通路在进展期黑色素瘤的探索
研究背景：联合阻断PD-L1通路和促癌丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路可使晚期黑色素瘤的抗肿瘤反应时间延长。
研究设计：这是一项I期、开放标签、剂量递增及扩展的临床研究（NCT02027961）。该研究共包括三个队列，队列A探索了度伐利尤单抗（3mg/kg Q2W或10mg/kg Q2W）联合达拉非尼150mg BID和曲美替尼2mg QD 用于晚期BRAF突变黑色素瘤的安全性、耐受性以及初步疗效（n=26），队列B同时给予度伐利尤单抗10mg/kg Q2W和曲美替尼 2mg QD治疗BRAF野生型晚期黑色素瘤患者（n=20）。队列C采用曲美替尼口服42天，然后在给药29天时加入度伐利尤单抗10mg/kg Q2W治疗BRAF野生型黑色素瘤患者（n=22）。
研究结果：在度伐利尤单抗联合达拉非尼、曲美替尼治疗期间不良事件和停药率比免疫单药或双靶用药更常见。3级严重不良事件发生例数为：A组18例（69.2%）(其中度伐利尤单抗3mg/kg Q2W组3例, 10mg/kg Q2W组15例），B组16例（80.0%），C组16例（72.7%），无治疗相关性死亡。客观反应率为69.2% (A组)，20.0%（B组）和31.8%（C组），同时探索分析显示A组中免疫浸润的改变更常见，A组中69%的患者显示治疗第15天CD8+细胞密度增加；A组IFN-γ在15天后高水平的维持较其余两组更常见。
研究结论：度伐利尤单抗联合达拉非尼和曲美替尼可能成为晚期黑色素瘤患者的治疗选择，且肿瘤环境中免疫浸润改善和持久抗肿瘤反应呈正相关。
图3 NCT02027961研究设计
表1 治疗相关不良反应汇总
表2 临床疗效
3. KEYNOTE-022第3部分：帕博利珠单抗，达拉非尼和曲美替尼治疗BRAF突变黑色素瘤的随机、双盲II期研究
背景：在KEYNOTE-022研究之前披露的结果中，帕博利珠单抗联合达拉非尼和曲美替尼（三联组）较安慰剂联合达拉非尼和曲美替尼（双靶组）延长了无进展生存期（PFS），但是未能达到统计学显著性差异。本文旨在对PFS、缓解持续时间(DOR)和总生存期(OS)的成熟结果进行报道。
方法：双盲、II期KEYNOTE-022研究入组了来自7个国家的22个中心的BRAF V600E/K突变晚期黑色素瘤初治患者。按照1:1的比例随机分配后，患者接受静脉给予帕博利珠单抗（200mg/3W）或者安慰剂，均联合达拉非尼（150mg BID 口服）和曲美替尼（2mg QD 口服）。主要研究终点为PFS、DOR和OS。通过意向治疗人群评估疗效，通过至少接受1剂试验药物的全部患者来评估安全性。该分析之前没有在方案中规定。
结果：2015年11月30日至2017年4月24日，120例患者随机接受三联治疗（n=60）或双靶治疗（n=60）。随访36.6个月，三联组中位PFS16.9个月（95%CI 11.3~27.9），双靶组10.7个月（95%CI 7.2~16.8；HR 0.53，95%CI 0.34~0.83）。三联和双靶组24个月PFS率分别为41.0%（95%CI 27.4%~54.2%）和16.3%（95%CI 8.1%~27.1%）；中位DOR分别为25.1个月（95%CI 14.1~NR）和12.1个月（95%CI 6.0~15.7）；中位OS三联组未达到，双靶组为26.3个月(HR=0.64；95%CI 0.38~1.06)。三联和双靶组24个月OS率分别为63.0%(95%CI 49.4%~73.9%)和51.7%（95%CI 38.4%~63.4%）。三联组中的35位患者（58%，其中1例死亡）和双靶组中的15位患者（25%）发生了3-5级治疗相关不良事件（TRAEs）。
结论：在BRAF V600E/K突变的晚期黑色素瘤中，帕博利珠单抗联合达拉非尼和曲美替尼可延长PFS、DOR和OS，TRAEs也随之升高。由于是事后分析，对此结果的解释存在局限性。
图4 Kaplan-Meier曲线；(A)PFS (B)OS
图5 DOR的Kaplan-Meier曲线
在KEYNOTE-022研究之前发表的文章[Nat Med 2019;25:941–6]中，三药组和两药组的中位PFS分别为16.0个月和10.3个月(HR=0.66，95%CI 0.40~1.07; P=0.043)，没有达到预设的研究终点(研究预设P值为0.025)。但这是中位随访9.5个月，出现了72个PFS事件的结果。该研究设计需要至少74个PFS事件来拒绝无效假设。因此，随访时间不够可能影响了研究结果。尽管这次的分析不是方案预设的，但是在中位随访36.6个月后，数据更成熟，两组间PFS、DOR和OS的差异更明显。随着随访时间的延长，三药组出现更深、更持久的缓解、更高的CR率，PFS、OS和DOR曲线呈现进一步分离的趋势。当然，三药组也伴随着不良反应的明显增加。亚组分析显示在所有患者亚组均能获益，尤其是在小于65岁、男性和乳酸脱氢酶（LDH）升高的患者中。KEYNOTE-022研究两次随访的不同结果带来的教训是，在免疫联合治疗的研究中，随访时间可能是一个重要的因素，早期的数据截止可能不能反映真正获益的程度。
靶向和免疫联合治疗BRAF突变晚期黑色素瘤已有三项研究结果公布，包括IMspire150研究、COMBI-i研究和KEYNOTE-022研究。IMspire150研究对比维莫非尼+考比替尼±阿替利珠单抗，结果达到主要终点，三药组和两药组的中位PFS分别为15.0个月和10.6个月(HR=0.78；95%CI 0.63~0.97；P=0.025)。COMBI-i研究对比达拉非尼+曲美替尼±Spartalizumab，结果未达到主要终点，三药组和两药组的中位PFS分别为16.2个月和10.2个月(HR=0.82，95%CI 0.655~1.027，P=0.042)，无统计学差异(研究预设P值为0.025)。考虑到不同研究结果的不一致性，靶向联合免疫在BRAF突变晚期黑色素瘤中还需要更多的前瞻性研究明确，包括治疗人群的筛选、治疗方案的优化、不良反应的管理等。
4. 循环肿瘤DNA(ctDNA)对接受系统治疗的黑色素瘤患者预后的影响
研究目的：ctDNA已被证实为黑色素瘤治疗中颇具潜力的生物学预测指标。本研究通过对真实世界中的转移性黑色素瘤患者队列的血浆ctDNA进行分析，旨在评估ctDNA对接受系统治疗的转移性黑色素瘤患者疗效的预测价值。
研究方法：本研究分析了142例既往接受系统治疗的转移性黑色素瘤患者的血浆样本，其中70例既往接受BRAF/MEK抑制剂治疗，72例既往接受免疫治疗。采用液滴数字聚合酶链反应测定法检测患者特异性ctDNA。
研究结果：一线接受免疫治疗(PD-1/CTLA-4)的患者中，有56%检测到了血浆ctDNA，显著低于BRAF抑制剂患者队列中ctDNA的检出率(76%，P= 0.0149)。在治疗12周内ctDNA水平的降低与治疗反应密切相关(Cohen's k = 0.798，P<0.001)，并预示着更长的无进展生存期获益。值得注意的是，与使用BRAF/MEK抑制剂的患者相比，接受免疫治疗的患者的ctDNA下降较慢。对9例接受抗PD-1治疗的患者进行了ctDNA的全外显子组测序，以评估肿瘤突变负荷(TMB)和新抗原负荷。结果显示，治疗有反应者较无反应者有更高的TMB和新抗原负荷趋势。
研究结论：总体而言，我们的数据表明ctDNA的变化可以作为接受系统治疗的转移性黑色素瘤患者预后的早期指标，可以作为指导治疗决策的工具。
图6 治疗早期ctDNA水平与治疗反应的相关性
A)在接受12周系统治疗，获得6个月的最佳临床反应与ctDNA生物反应之间的一致性。分为临床反应者(PR/CR, n=61)，疾病稳定的患者(SD，n=7)和疾病进展的患者(PD, n=16)。根据治疗前12周的ctDNA生物学反应，判断其进展和ctDNA响应者(A和B组；n=69)或无响应者(C组；n=15)。 B-C)对靶向治疗(n=26)和免疫治疗(n=6)有反应的患者在基线和随访时血浆ctDNA水平。显示了成对t检验的P值。每组的几何平均ctDNA浓度用红色虚线表示
图7 治疗期间早期ctDNA水平与生存获益的关系：免疫疗法(A、B)或靶向疗法(C、D)治疗的患者在三个亚组(A、B、C)的无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)曲线
接受免疫治疗或靶向治疗的患者分为三组：A=基线水平未检测到ctDNA，但对治疗有生物学反应，B=基线水平可检测到ctDNA，在治疗期间无法检测到或对治疗有明显的生物学反应，C=基线水平可检测/不可检测到ctDNA，在治疗过程中仍可检测/变成可检测到ctDNA但对治疗无生物学反应
在黑色素瘤患者中已经有数项研究显示ctDNA与预后的关系。这项研究发现晚期黑色素瘤患者中，基线和治疗过程中ctDNA的可检测性是临床预后的强预测因子。基线和治疗开始12周内ctDNA水平高的患者，一线免疫治疗或靶向治疗的生存更短。而且，基线和治疗过程中ctDNA不可测的患者，不管何种治疗，至疾病进展时间更长。这提示ctDNA可以作为黑色素瘤患者早期疗效预测的因子。这项研究还发现接受免疫治疗的患者，ctDNA水平降低的速度慢于接受靶向治疗的患者。这和临床当中观察到免疫治疗起效比较慢是一致的。由于ctDNA检测的可重复性，ctDNA可能可以填补黑色素瘤患者疾病进展情况的血液学生物标志物的空白，用于黑色素瘤患者复发的监测、疗效的预测、预后的判断等。但是将ctDNA检测应用于黑色素瘤患者临床还有一定的局限性。例如，不是所有患者可检测到ctDNA，大部分可检测到ctDNA的患者为具有内脏转移的患者，特别是肝转移。还有，不同的检测试剂可能有不同的敏感性和特异性。ct-DNA检测高昂的价格以及未纳入医保也限制了其临床使用。关于黑色素瘤患者ctDNA检测标准的建立以及与临床的相关性，还需要更多的研究来证实。
5. BRAF作为阳性预测生物标志物：关注肺癌和黑色素瘤患者
在个体化医疗时代，对于晚期黑素瘤和非小细胞肺癌(NSCLC)患者，必须进行BRAF突变评估。 识别可干预的突变对于充分管理这些患者至关重要。迄今为止，各种药物已在临床实践中应用。同样，鉴定BRAF突变可以采用多种方法。 在这里，我们简要回顾了有关BRAF在黑色素瘤和NSCLC中的最新文献，尤其关注这些患者采用的不同方法和药物。 此外，还概述了在分子预测病理学检测方面具有丰富专业知识的意大利不同实验室的实际操作。
图8 NSCLC样品收集(A)和组织学样品的临床前处理，从福尔马林固定和石蜡包埋(B)，组织切片制备(C)和染色(D)开始。经过形态学评估和诊断(E)后，制作系列组织切片以评估临床相关的预测性生物标志物(EGFR、BRAF、ALK、ROS1和PD–L1)。在图的下部，报告了细针穿刺(F)，从快速染色(G)到载玻片制备(H)的快速现场评估(ROSE)，以进行形态学评估(I)。 此外，还制备了一个细胞块(L)以获得系列切片(M)，将其用苏木素染色进行显微镜评估(N)后，用于临床相关的生物标志物评估
图9 黑色素瘤样本收集(A)和组织学样本的临床前处理，从福尔马林固定和石蜡包埋(B-C)开始，组织切片制作和染色，用于形态学评估和诊断(D)。提取DNA (F)，并使用基于RT-PCR (G)的方法或基于测序的方法(H)进行分析。基于RT-PCR的方法(G) 快速的扩增曲线 (红到绿色)的示意图表示，以强调黑色素对DNA扩增的影响
[1] Intermittent Inhibition of BRAF plus MEK Is Not Beneficial in Melanoma. Cancer Discov. 2020 Dec;10(12):OF7.
[2] Ribas A, Algazi A, Ascierto PA, et al. PD-L1 blockade in combination with inhibition of MAPK oncogenic signaling in patients with advanced melanoma. Nat Commun. 2020 Dec 7;11(1):6262.
[3] Ferrucci PF, Di Giacomo AM, Del Vecchio M, et al. KEYNOTE-022 international team. KEYNOTE-022 part 3: a randomized, double-blind, phase 2 study of pembrolizumab, dabrafenib, and trametinib in BRAF-mutant melanoma. J Immunother Cancer. 2020 Dec; 8(2): e001806.
[4] Marsavela G, Johansson PA, Pereira MR, et al.The Prognostic Impact of Circulating Tumour DNA in Melanoma Patients Treated with Systemic Therapies-Beyond BRAF Mutant Detection. Cancers (Basel). 2020 Dec 16;12(12):3793.
[5] Malapelle U, Rossi G, Pisapia P, et al. BRAF as a positive predictive biomarker: Focus on lung cancer and melanoma patients. Crit Rev Oncol Hematol. 2020 Dec; 156: 103118.
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