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姚飞教授丨双信号精准追踪：创新生物传感器在监测NSCLC患者PD-L1与评估治疗进展中的应用

2023年11月25日

整理：肿瘤资讯

来源：肿瘤资讯

细胞程序性死亡配体1（PD-L1）的表达水平是肿瘤检测的关键，并且作为衡量肿瘤对免疫检查点抑制剂（ICI）治疗反应的重要生物标志物。普遍认为，高水平的可溶性PD-L1（sPD-L1）与较差的预后相关联，相反，低水平的sPD-L1预示着更佳的临床效果。因此，精确监测sPD-L1水平对于早期发现肿瘤和有效监控免疫治疗进程至关重要。尽管已有多种检测PD-L1的方法，如免疫组织化学、蛋白质印迹法和流式细胞术等，但这些技术仍存在一些限制。鉴于此，研究人员致力于开发一种创新的电化学传感器，该传感器采用双信号输出机制，旨在显著提升检测的精确性和可靠性。这一新型传感器采用一种新颖的氧化还原指示剂——邻氨基苯酚对磺酸（OAPPSA），并通过电化学聚合技术，在电极表面构建导电聚合物与还原氧化石墨烯（rGO）的复合层，以优化电子传输效率，增强传感器性能。

研究方法

在本研究中，制备过程包括将氧化石墨烯（GO）超声分散在水中，通过肼水合物还原得到rGO，并与TBA溶液混合形成rGO-TBA复合材料，该材料用于修饰电极表面。印刷电极（SPEs）经过盐酸循环清洁以去除污染物，随后rGO-TBA复合材料滴涂于SPEs上并聚合形成rGO-pTBA复合膜。通过EDC/NHS激活的羧基，将核酸适配体共价固定于电极上，形成探针。探针最后在牛血清白蛋白溶液中处理以减少非特异性结合。使用来自健康个体和接受PD-1/PD-L1抑制剂治疗的晚期NSCLC患者的血清样本进行测试。血清样本用PBS稀释后，PD-L1蛋白在与传感器探针接触前用OAPPSA进行标记。通过计时安培法测量电流响应，并通过电化学阻抗谱（EIS）验证方法的可靠性。实验采用标准添加法，每组重复三次，确保结果的准确性和可重复性。

研究结果

在本研究中，我们通过场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）和X射线光电子能谱（XPS）对感测层的逐步改性进行详细的表面分析。首先，观察rGO、rGO-pTBA和（rGO-pTBA）-Apt三层结构的FE-SEM图像，发现核酸适配体的固定使电极表面变得更加粗糙和厚实，这表明核酸适配体的成功附着。XPS光谱分析进一步证实rGO-pTBA复合材料在电极上的成功改性以及核酸适配体的固定，通过观察到特定元素的峰值变化，如S 2p、N 1s和P 2p峰，这些峰在（rGO-pTBA）-Apt层中出现，而在rGO层中未观察到。C 1s的分解光谱显示rGO层中不同化学键的特征峰，而rGO-pTBA层中由于rGO与CPs的相互作用导致峰位的移动，并且在（rGO-pTBA）-Apt层中观察到由酰胺键形成引起的额外峰。S 2p峰的分解显示pTBA主链上的C–S键，而N 1s和P 2p峰的分解则揭示核酸适配体中磷酸基团的存在。O 1s光谱的分解进一步证实核酸适配体在传感器探针上的成功固定（图1）。

图1. 传感层的特征和形态

测试在两种不同的电解质溶液中进行：4.0 mM的Fe（CN）63−/4−/1.0 M KNO3和4.0 mM的Ru（NH3）63+/4+/1.0 M KNO3。Rct值的确定是通过Zview2软件拟合等效电路的参数得出的。测试结果表明，裸露的SPE由于导电性低而显示出较高的Rct。通过预处理电极表面，这一问题得到显著改善。rGO改性层在两种溶液中均显示出较低的Rct值，证明其良好的导电性。而rGO-pTBA改性层的Rct值增大，表明聚TBA的导电性不如rGO。核酸适配体的固定进一步改变Rct值，这在Fe（CN）63−/4−溶液中Rct值增大，在Ru（NH3）63+/4+溶液中Rct值减小，这可能是由于带负电荷的核酸适配体层吸引带正电荷的Ru（NH3）63+/4+物种。此外，通过循环伏安法（CV）研究每个探针层的表面电荷。SPE/rGO层的氧化还原峰电流显著增加，而rGO-pTBA改性层的电流减少，这可能是由于pTBA的负电荷与Fe（CN）63−/4−离子的静电排斥。核酸适配体固定后，CV峰值进一步减小，表明SPE/（rGO-pTBA）-Apt传感器探针带有负电荷，这一现象在含正电荷的钌离子溶液中得到验证（图2）。

图2. 传感器探针的电化学性质

在开发用于安培检测PD-L1的传感器之前，通过CV验证一种新型氧化还原指示剂OAPPSA作为电子传递介质的可行性。实验结果显示，在0.1M PBS缓冲溶液（pH 7.4）中，OAPPSA具有明显的氧化还原峰。利用EDC/NHS偶联化学方法，OAPPSA成功标记在PD-L1蛋白上，并通过传感器探针捕获，产生可测量的响应电流。通过CV测试，确认氧化还原指示剂与PD-L1的有效结合，并且优化传感器性能，包括核酸适配体浓度、温度、pH和反应时间。实验确定1.0 μM的核酸适配体浓度、35°C的反应温度、pH 7.4以及4分钟的反应时间为最佳条件，以确保传感器达到最佳检测性能。这些优化步骤确保传感器在实际应用中的准确性和可靠性，为临床样本分析提供适宜的条件。

图3. PD-L1传感的分析变量

在优化的实验条件下，通过EIS和计时安培法（CA）验证传感器对PD-L1的定量性能。实验结果显示，EIS和CA方法都能够对PD-L1进行灵敏和选择性的检测，具有双斜率的线性动态范围，并且检测限（LOD）均达到皮摩尔级别。EIS方法的灵敏度为6.37 ± 0.64 和 1.59 ± 0.02 kΩ pM−1 cm−2，而CA方法的灵敏度为0.51 ± 6 × 10−3 和 0.22 ± 9.2 × 10−4 μA pM−1 cm−2。两种方法的LOD分别为1.85 ± 0.04 pM （RSD ≤5.2%）和 0.20 ± 0.001 pM （RSD ≤5.2%）。实验中观察到的双斜率校准曲线可能与不同浓度下PD-L1的核酸适配体-目标相互作用的动力学差异有关。在低浓度范围内，氧化还原动力学可能主要由Nernst扩散层内吸附物种的短程电子转移控制，而在高浓度范围内，可能受到受体-目标复合物主链的短程和长程电子转移的影响。此外，所开发的生物传感器的检测范围能够覆盖NSCLC患者和健康个体血液中PD-L1的水平，这表明传感器在实际应用中的潜力（图4）。

图4. sPD-L1传感器的分析性能

研究结论

本研究开发一种电化学双重检测PD-L1生物传感器，用于癌症检测和免疫治疗进展监测。该传感器设计简洁，操作简便，通过EIS和CA两种方法对PD-L1进行检测。此外，该生物传感器原型未来有望成为多种医疗应用的POCT工具，能够通过测定血清中的sPD-L1水平，为癌症的早期诊断和治疗监测提供帮助。

专家点评

姚飞

博士，副主任医生

南京医科大学附属江宁医院胸外科
中国胸外科三维重建及人工智能联盟委员
AME出版社通讯员
2017年强生手术菁英赛江苏赛区肺切除组二等奖
2018年强生手术菁英赛江苏赛区肺切除组二等奖
2019年强生手术菁英赛全国肺段切除组二等奖
以第一作者及通信作者身份在Ann Thorac Surg，European Radiology，Surgical Endoscopy，Journal of Surgical Oncology，International Journal of Surgery发表15篇SCI文章

姚飞教授对本研究的评价中总结其核心贡献和潜在影响：研究团队成功开发一种新型电化学传感器，该传感器利用电化学阻抗谱和计时安培法的双信号输出机制，显著提高对肿瘤生物标志物sPD-L1监测的准确性和可靠性，这对于肺癌的早期诊断和免疫治疗监测极为关键。通过创新性地应用邻氨基苯酚对磺酸作为氧化还原指示剂，并构建导电聚合物与还原氧化石墨烯的复合层，传感器展现出优化的电子传输效率和增强的性能。经过FE-SEM和XPS的详细表面分析，确认核酸适配体在传感器表面的成功固定和复合材料的改性效果，同时，通过精心优化的传感器性能，包括核酸适配体浓度、温度、pH和反应时间的调整，确保在最佳条件下的检测性能。实验结果揭示传感器在检测PD-L1方面具有出色的灵敏度和选择性，检测限达到皮摩尔级别，能够有效区分健康个体和晚期NSCLC患者血清样本中的sPD-L1水平，并监测免疫治疗过程中sPD-L1水平的变化以评估治疗效果。姚飞教授认为，这种电化学双重检测PD-L1生物传感器在经过进一步的临床验证和优化后，有望成为现场快速检测的重要工具，对提升癌症患者的生存率和生活质量产生深远的积极影响。

参考文献

Saputra HA, Chung JH, Sahin MAZ, et al. Dual-signal output biosensor for the detection of program death-ligand 1 and therapy progress monitoring of cancer. Biosens Bioelectron. 2024 Oct 15;262:116565.

责任编辑：肿瘤资讯-Bear
排版编辑：肿瘤资讯-Rex