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【中国好声音】有望打破T-ALL治疗僵局：川大华西开发的mRNA-CD5-CAR-γδTCD5−细胞疗法，展现巨大潜力

07月30日

编译：肿瘤资讯

来源：肿瘤资讯

在T细胞急性淋巴细胞白血病（T-ALL）中，CD5因其在恶性T-ALL细胞表面的独特表达，成为嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法的潜在候选者。四川大学华西医院仝爱平教授、聂春来教授、牛挺教授等领衔开展了一项研究，该研究使用编码特异性重组CD5-VHH-CAR的mRNA电穿孔进行工程改造，以构建CD5-CAR-γδT^CD5−，并进行后续研究。该研究结果近日发表于Advanced Science。【肿瘤资讯】对该研究内容进行整理，以飨读者。

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mRNA-CAR-T技术为T-ALL提供安全有效的治疗方案

CAR-T细胞通过基因工程改造，使其在表面表达CAR分子，这些分子能够识别和结合靶细胞表面的抗原。纳米体（Nbs）因其高特异性、稳定性和亲和力，成为CAR-T抗原靶向的有前景领域。

CD5是T-ALL中恶性T细胞上表达的标记物之一，因此CD5也成为CAR-T细胞疗法的潜在靶标。然而，CD5在CAR-T细胞上的表达会导致同型杀伤，因此会降低疗效。γδT细胞由于不依赖经典的人类白细胞抗原（HLA）分子识别，并且可以实现异基因移植，成为一种有前景的替代方案。此外，传统的CAR-T细胞通过病毒载体进行基因转导存在风险，而mRNA-CAR-T技术则提供了一种安全、快速且经济高效的替代方案。

CD5-Nbs的制备、筛选及表征

本研究选择了一只3岁的健康骆驼，用高纯度重组CD5细胞外结构域蛋白进行皮下免疫接种。通过一系列选择过程，研究鉴定出4种靶向CD5的纳米抗体CD5-6、CD5-18、CD5-27和CD5-63。随后，由HEK293T细胞进行了CD5-Nbs的表达，并评估了CD5-Nbs与CD5的特异性结合。最终，一系列评估发现了CD5-27-Nb作为治疗靶蛋白的潜力，值得进一步探索其在癌症免疫治疗中的应用（图1）。

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图1.特异性纳米抗体筛选和CD5-Nbs的表征

敲除CD5防止自相残杀，提高CAR-T功能

通过流式细胞术，本研究分析了健康供体和T-ALL患者外周血中CD5 T细胞的存在情况。结果表明，CD5-27-Nb在T细胞表面的表达导致CD5-CAR-T细胞自相残杀，导致CD5 T细胞频率降低和CD5-CAR-T细胞群减少。为了维持CD5-CAR-T细胞的扩增和活性，在CAR转导之前使用CRISPR/Cas9在T细胞中破坏CD5基因，从而消除T细胞表面的CD5表达。此外，CD5基因的缺失不会影响与T细胞活性相关功能基因的表达（图2）。

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图2. 使用CRISPR/Cas9系统有效破坏T细胞中的CD5基因可防止自相残杀，而不会影响T细胞功能

制备γδTCD5-细胞

本研究通过刺激PBMC的IPP和IL-2，可富集和扩增γδT细胞，使γδ-2-T细胞浓度达到90%。在CAR转导前，使用CRISPR/Cas9技术敲除CD5基因。通过电穿孔法将mRNA转染到细胞中，使其表达CD5-Nb-CAR或对照的CD19-Nb-CAR，不论是γδT^CD5-细胞还是其他细胞，均显示出75.4%~94.2%的高CAR表达水平，且持续约1周（图3）。

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图3. γδTCD5-细胞构建

CD5-CAR-γδT^CD5−在体外表现出特异性并对恶性T细胞系表现出强大的细胞毒性

本研究中，通过效应CAR-γδT细胞和恶性T细胞系共培养实验在体外评估CAR-γδT细胞的细胞毒性。研究结果表明，CD5-CAR-γδT^CD5−细胞可有效裂解CD5+ CCRF-CEM和MOLT-4细胞，但不能裂解CD5− K562和Molm13细胞，证明它们可特异性识别CD5。此外，一系列细胞毒性试验结果表明，显示出CD5-CAR-γδT^CD5−对CD5+恶性细胞增殖的抑制作用，表明其具有特异性的免疫治疗作用（图4）。

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图4. 体外抗肿瘤功效

在此基础上，研究团队向NSG小鼠模型体内注射了携带荧光素酶报告基因（CCRF-CEM.ffLuc）的细胞，以建立全身性T-ALL异种移植模型。结果显示，在第16天，通过生物发光成像发现该组小鼠体内无肿瘤细胞，CD5-CAR-γδT^CD5−组显著延缓了肿瘤进展并延长了小鼠的生存时间。暂停给药后，3/5只小鼠在第60天之前未见肿瘤复发，而对照组小鼠T-ALL进展迅速，大多数在第30天左右死亡。治疗后的小鼠体重和细胞状态无显著差异，显示出该疗法具有良好的安全性（图5）。

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图5. CCRF-CEM异种移植模型中的抗肿瘤活性

mRNA-CAR-γδT^CD5-细胞在T-ALL治疗中展现出巨大潜力，未来有望进一步发展

本研究展示了CD5-CAR-γδT^CD5−细胞对恶性T细胞系表现出有效的抗肿瘤效果。这一发现表明，CD5-CAR-γδT^CD5−疗法在未来临床治疗T-ALL中具有潜力。研究结果强调了利用特异性抗原靶向结构域，结合CRISPR/Cas9 基因编辑和mRNA技术的创新应用，展现了更有效、更安全的CAR-γδT细胞疗法的临床应用潜力。

尽管mRNA-CAR-γδT^CD5-细胞在T-ALL治疗中展现出潜力，但仍存在一些需要克服的挑战。首先，如何优化γδT细胞的CAR设计，以提高其在体内的扩展和持久性。其次，需要进一步深入研究，以减少潜在的脱靶效应，确保治疗的安全性。再者，尽管mRNA技术在本研究中展现出优势，但其在临床实践中的可行性和有效性仍需更多验证。总的来说，mRNA-CAR-γδT^CD5-细胞为T-ALL治疗提供了一种创新且有前景的疗法，期待未来能够获得进一步发展和应用。

参考文献

Zhu Z, Li H, et al., mRNA-Engineered CD5-CAR-γδT Cells for the Immunotherapy of T-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia. Adv Sci (Weinh). 2024 Jul 16:e2400024.

责任编辑：肿瘤资讯-Kaylee
排版编辑：肿瘤资讯-Kaylee

考考你

关于mRNA改造的CD5-CAR-γδT^CD5-细胞在T-ALL免疫治疗中的应用，下列说法哪项正确？（单选）
A．CD5-CAR-γδT^CD5-细胞在体外实验中表现出较低的抗肿瘤活性。
B．研究表明，CD5-CAR-γδT^CD5-细胞在体内实验中未能显著延长荷瘤小鼠的生存时间。
C．研究使用了CRISPR/Cas9技术敲除CD5基因以避免同型杀伤。
D．mRNA技术在构建CAR-T细胞中展示了较低的安全性和有效性。