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使用基于RNA技术的液体活检检测NSCLC中ALK、ROS1、RET融合和METΔex14

2023年09月02日

编译：肿瘤资讯

来源：肿瘤资讯

ALK、ROS1和RET融合和METΔex14突变与非小细胞肺癌（NSCLC）靶向治疗反应相关。组织融合测试技术必须适应液体活检，而液体活检通常是唯一可用的材料。在本研究中，从液体活检中纯化循环游离RNA（cfRNA）和细胞外小泡RNA(EV-RNA）。融合和METΔex14转录物通过nCounter(Nanostring)和使用QuantStudio系统(Applied Biosystems)的数字PCR（dPCR）进行分析，以验证这些技术用于基因融合和METΔex14跳突液体活检的可行性。本文已于2023年5月发表于Mol Oncol。

背景

肺癌仍然是全球癌症死亡的主要原因，其中NSCLC占所有诊断出的肺癌的80%以上。尽管影像学技术不断发展，但大多数病例仍是在晚期才被诊断，预后较差。一些基因突变已被证实为NSCLC的致癌驱动因子，包括点突变、缺失、插入或基因融合。其中，驱动基因融合和跳跃突变存在于10%～15%的患者中。NSCLC中常见的基因融合包括ALK、ROS1和RET融合，而METΔex14跳突发生率约3%～4%。这些融合突变以及跳跃突变基因与其他驱动基因互斥。

最初，通过基于PCR技术针对单个变异的方法对临床活检样本中的基因融合和跳跃突变进行鉴定和表征。但不幸的是，相当数量的晚期NSCLC患者用于遗传分析的肿瘤组织可获得性存在问题，无法进行活检，或者只能获得细胞标本或小样本活检。此外，进行重复活检以监测疾病进展或检测药物耐药性通常由于活检样本不足无法进行。液体活检是一种微创、安全，敏感性高的替代防范，已被越来越多地用于与肿瘤相关的基因突变的研究。液体活检样本包括血液、胸腔积液、腹水或脑脊液，以及这些液体中的不同成分，包括循环游离核酸、循环肿瘤细胞、细胞外囊泡或血小板等多种生物材料。其中从血浆或血小板中纯化出的循环游离DNA和RNA（cfDNA和cfRNA）最常用。本研究在晚期NSCLC患者中使用液体活检，并采用nCounter和dPCR进行分析，验证这些技术用于ALK、ROS1、RET融合和METΔex14跳突液体活检的可行性。

结果

共有56个液体活检样本用于cfRNA纯化和nCounter方法的验证，其中40份样本来自基因融合或METΔex14跳突阳性患者，这些患者之前通过nCounter、FISH、IHC和/或NGS对FFPE组织进行了基因分型；其他16份样本作为对照。纳入的56例液体活检样本通过nCounter获得了有效的结果，显示持家基因（HK）水平高于之前确定的阈值。由Qubit测定cfRNA中提取物的浓度为0.4～70 ng RNA/µL。cfRNA提取物的浓度或输入RNA的总量与HK水平之间没有发现相关性。

16份对照样本在nCounter面板的23个探针均为阴性。来自肿瘤患者的40份cfRNA样本中，有28份样本识别出改变的转录物，包括10份ALK，6份ROS1，7份RET融合转录物和5份METΔex14跳突。异常转录本的阳性是相互排斥的，在cfRNA中发现的改变总是与之前在FFPE活检中发现的改变一致。nCounter在液体活检中对改变的转录物的检测显示，对组织的敏感性从RET融合的58%到METΔex14跳突的100%不等，在所有情况下的特异性为100%。总体而言，nCounter显示出70%（95% CI 54.6-81.9）的敏感性和100%（95% CI 97.8-100）的特异性，与组织中的基因分型几乎完全一致。

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图1. cfRNA样本的nCountter和dPCR分析结果（A）nCounter和dPCR检测cfRNA样本融合和METΔex14的百分比（B）ALKv1、CD74-ROS1和KIF5B-RET重排阳性和阴性样本总数计数比较（C）nCounter对METΔex14跳突阳性与阴性患者计数的比较

ALKv1、CD74-ROS1和KIF5B-RET融合转录本阳性的液体活检样本的中位数分别为6756、4063和6911；阴性样本的计数分别为8、6和3。在所有病例中，差异均有统计学意义（P＜0.001）。对其余的ALK、ROS1和RET变异也得到了类似的结果。对于METΔex14跳突，对照样品中跳跃与wt探针的中位数比为0.1，而阳性样品中跳跃与wt探针的中位数比为1.7，差异显著（P<0.001）。在液体活检中，阳性PE样本的nCounter计数通常高于血液样本，但未达到统计学意义，可能是由于样本数量较少。

采用dPCR作为正交方法来分析来自组织阳性患者的40份cfRNA样本，在25份样本（62.5%）中鉴定出异常转录物，除RET融合转录物外，dPCR检测基因改变的检出率略低于nCounter。两种技术的总体一致性为57.5%（23/40），仅考虑ALK样本时为71.1%（10/14）。此外，结合nCounter和dPCR技术，可以在87.5%的样本中检测到所分析的融合转录本和METΔex14跳突。

微信截图_20230828112914.png 图2. cfRNA和EV-RNA样本中nCounter和dPCR结果的一致性（A）正交研究中肿瘤阳性患者液体活检热图（B）图A的结果总结（C）采用dPCR（左图）和nCounter（右图）对连续液体活检样本的融合分析结果

通过NGS、FISH、IHC或qPCR，从另外28例ALK重排（n=26）、RET重排（n=1）或METΔex14跳突（n=1）阳性的NSCLC患者的血液中分离出细胞外囊泡。对FFPE样本的NGS分析能够识别12例的融合变异；其余16例FFPE活检没有足够的NGS材料。CD9、CD81和CD63四酯酶的表达在细胞外囊泡RNA（EV-RNA）中得到证实，随后纯化EV-RNA，并通过dPCR和nCounter进行分析。

dPCR检测结果如下，4/28份EV-RNA样本（14.3%）由于内源性基因（PUM1）检测低或未检测到而无法评估。在13/28个样本（46.4%）中，使用靶向组织中存在的异常转录物的引物（4/9）或在组织中无法表征时最常见的变体（9/15）鉴定了致癌变体。具体而言，在EV-RNA中发现的致癌转录物为EML4-ALKv3（n=6)、v1（n=4）和v2（E20:A20）（n=1）、KIF5B-RET(K15:R12)(n=1)和METΔex14跳突（n=1）。nCounter检测结果如下，由于HK计数低，10/28个样本被认为不可评估。在成功分析的18个样本中，有4个样本（22.2%）检测到异常转录物。

在FFPE组织中，5例存在ALK（n=1）或RET（n=3）融合和METΔex14跳突（n=1）的患者有基线时血液样本和对TKIs反应的评估。在两例进展性疾病病例中，dPCR突变拷贝数增加对应于血液中转录物的改变。相反的，在疾病稳定的两例患者中，dPCR突变拷贝数保持在相同的数量范围内，而在一例经TKI治疗后显示部分反应的患者中，观察到突变拷贝数减少5倍。在其中三例患者的nCounter计数中观察到类似的趋势，而在另外两例患者中，序列样本始终为阴性。

结论

nCounter可用于液体活检中融合和METΔex14转录物的多重检测，显示出与二代测序平台相当的性能。dPCR可用于已知突变的患者的疾病随访。在这些分析中，cfRNA应优先于EV-RNA。

责任编辑：肿瘤资讯-Nydia
排版编辑：肿瘤资讯-Jianxu

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有效期至：2025-8-24

参考文献

Giménez-Capitán A, Sánchez-Herrero E, Robado de Lope L, et al. Detecting ALK, ROS1, and RET fusions and the METΔex14 splicing variant in liquid biopsies of non-small-cell lung cancer patients using RNA-based techniques [published online ahead of print, 2023 May 27]. Mol Oncol. 2023;10.1002/1878-0261.13468. doi:10.1002/1878-0261.13468.

*本材料由阿斯利康提供，仅供医疗卫生专业人士参考

2023年09月09日

靳文剑

江西省肿瘤医院 | 肿瘤内科

希望RNA测序尽早进入临床。

2023年09月08日

韩宪春

山西省中西医结合医院 | 肿瘤内科

肺癌仍然是全球癌症死亡的主要原因，其中NSCLC占所有诊断出的肺癌的80%以上。尽管影像学技术不断发展，但大多数病例仍是在晚期才被诊断，预后较差。

2023年09月08日

尹青

淄博市周村区人民医院 | 病理科

ALK、ROS1和RET融合和METΔex14突变与非小细胞肺癌（NSCLC）靶向治疗反应相关