近年来，FL生物学研究取得了重大进展，其中下一代测序（NGS）技术和相关技术在揭示FL的肿瘤基因组景观、转化和生存途径方面尤为关键。已有多种临床和基因组评分可以优化高危FL患者的鉴定，如m7-FLIPI、9POD24-PI10和基于23个基因表达的预测指标。但FL中除CREBBP、CARD11、FOXO1、KMT2D（MLL2）和EZH2等特定基因突变外，其他基因仍有待确定。而且，除了致病性单核苷酸变异（SNV）和异常基因表达外，已知几乎所有FL患者都存在拷贝数改变（CNA），并已被证明会影响预后。此外，对治疗产生耐药性的机制仍不明确。而早期进展病例的基因分析可用于鉴定导致耐药的分子通路中的新型遗传损伤（genetic lesions）。换句话说，多年来，人们一直在努力探索能够预测生存率或早期进展风险的生物学和遗传学因素，但迄今为止还没有明确的生物标志物被常规应用于临床。
为了解决上述问题，天津市肿瘤医院张会来教授及其团队对FL中突变等位基因进行了深入、高分辨率的基因组-外显子组分析，并在大样本FL患者中评估与POD24相关的分子学和临床变量，尤其是基因组改变。近期，该研究结果已发表于British Journal of Haematology杂志上，【血液肿瘤资讯】现将重点内容整理如下，以飨读者。
现任天津医科大学肿瘤医院淋巴瘤内科主任
主要研究方向：恶性淋巴瘤的分子诊断和个体化治疗
主要协会/学会任职：
中国抗癌协会淋巴瘤专业委员会副主任委员
中国临床肿瘤学会（CSCO）淋巴瘤专家委员会 常委
中国医促会肿瘤内科分会副主任委员
中国老年保健协会淋巴瘤专业委员会副主任委员
中国临床肿瘤学会（CSCO）肿瘤心脏病学专委 会常委
中华医学会肿瘤分会淋巴瘤学组委员
中国抗癌协会整合肿瘤心脏病学专委会委员
天津市抗癌协会淋巴瘤专业委员会主任委员
天津市血液病质控中心副主任委员
天津市医师协会血液医师分会副会长
与POD24相关的患者临床特征
本研究回顾性收集了2002年至2020年期间，在天津医科大学肿瘤医院、肿瘤研究所（TMUCIH）中新确诊的926例FL患者，根据纳排标准进行筛选后，最终共有415例患者被纳入分析（图1）。整个分析队列的主要临床特征和治疗结局见表1。
图1.研究流程总结
其中，21%的患者（n=86）在接受一线治疗后的24个月内出现疾病进展。表1总结了按POD24状态分类的患者基线特征。B症状（OR，2.36；P=0.007）、乳酸脱氢酶（LDH）水平升高（OR，2.38；P=0.006）、基线血红蛋白水平不佳（OR，3.30；P<0. 0001）、高风险FLIPI评分（OR，4.33；P<0.0001）、晚期FL（OR，2.14；P=0.029）或β2-M水平升高（OR，2.35；P=0.001）与POD24风险增加相关。
表1. 与POD24相关的患者基线特征
在纳入407例患者，包括了FLIPI、B症状和β2-M（FLIPI的变量，如血红蛋白、分期和LDH，不包括在内以避免冗余）的多变量Logistic回归模型中，高风险FLIPI评分是预测POD24的最重要变量（OR，3.30；P=0.002）（表2）。在接受R-chemo治疗的308例患者亚组中，高风险FLIPI评分（OR，4.24；P=0.004）也与POD24风险增加相关，包括在102例有WES数据的FL患者亚组中也是如此。
表2. POD24的Logistic回归模型
为了进一步评估POD24对OS的影响，研究人员采用了24个月的里程碑分析进行Kaplan–Meier曲线分析。正如预期，POD24与较差的OS有关，在前24个月内疾病进展的患者的3年和5年生存率分别为89.2%和78.6%，而在24个月无进展（non-POD24）的患者的3年和5年生存率分别为98.5%和96.2%。经B症状和β2-M调整并按FLIPI分层的多变量Cox模型显示，POD24与后续OS较差相关（HR，3.98；P=0.003；图2A）。此外，与POD24队列相比，non-POD24的患者更有可能在一线治疗后获得CR（54% vs. 35%，P=0.001）。
图2.POD24在FL中的预后影响以及根据POD24分层的FL患者亚群中涉及的驱动基因突变
与POD24相关的编码SNV
102例患者（29例POD24患者和73例non-POD24患者）的基因突变和CNA信息可用。在这些突变中，错义突变是主要类型。在SNV中，C>T突变在6种碱基转换类型中所占的比例最高（约60%），而且转换明显多于颠换。
在所有体细胞发生的非沉默突变中，有23个基因被认为是癌症驱动基因。中国FL患者的基因突变情况与西方FL队列略有不同，中国患者中HIST1H1D、ARID1B和STAT6基因突变频率较高，而BCL2基因突变频率较低。突变分析表明，POD24亚组中最常突变的基因（>19%的患者）与FL中几个重要通路相关，包括表观遗传调控和染色质重塑通路（KMT2D、CREBBP、NCOR2和ARID1A）、免疫逃避（IGLL5和TNFRSF14）、BCR和NK-κB（CARD11）、细胞凋亡抑制、细胞周期（BCL2）和JAK-STAT信号（STAT6）（图2B、C），但重要的信号通路相关基因突变频率在两个亚组之间无显著差异。值得注意的是，POD24亚组中参与核小体结构形成的HIST1H1D基因的突变频率明显高于non-POD24亚组（17% vs. 4%，P<0.05）。此外，POD24亚组中所有癌症驱动基因的总突变频率较高，尽管这一差异未达到统计学意义。
共突变和突变互斥性分析确定了14个具有统计学显著性的相互作用配对基因，其中STAT6突变与CREBBP（P<0.01）和TNFRSF14（P=0.01）突变显著共存，但与ATP6V1B2突变不共存（P=0.03）。
与POD24相关的CNA
染色体片段的缺失和重复（也称为拷贝数编译/CNA）通常被定义为DNA拷贝少于或多于两个的基因组结构变化；此外，众所周知，CNA在FL中很重要。为了确定FL中的常见CNA，研究人员对102份FL样本进行了分析，并采用癌症显著靶标基因组识别（GISTIC）算法对这些数据进行了评估。随后，研究人员用Circos图比较了POD24亚型和non-POD24亚型中的常见CNA（图3A、B）。
在基因水平的拷贝数增益分析中，研究人员发现大多数与POD24相关且P<0.05的基因都聚集在5个染色体区域。与POD24关联性最强的区域包括6p21.1-6p22.2、6q12-6q24.2和18q11.2-18q22.2（图3C）。同样，在基因水平拷贝数丢失分析中，虽然仅检测到了微小的变化，但大多数发生染色体丢失的基因都聚集在3个区域。
在染色体1p上，发现了56个基因缺失，其中NBPF1近端的基因簇P值为0.003，PRDM2为P=0.038。在染色体9q上，发现了70个基因缺失，其中SET附近的多个基因的P值为0.02（图3D）。为了评估某些CNA是否能独立于FLIPI预测POD24，研究人员将它们逐一与FLIPI一起纳入logistic回归模型，后者是整个系列中最相关的变量。在这些分析中，发现6p22.2（HIST1H1D；P=0.02；HR=4.75）和18q21.33（BCL2；P=0.03；HR=3.23）的增益以及1p36.13（NBPF1；P<0.01；HR=5.73）的缺失可预测POD24，而与FLIPI无关。
图3. 与POD24相关的CNA增益和缺失
已确定的基因改变和临床结局
所发现的可用于预测POD24的CNA（6p22.2和18q21.33的增益以及1p36.13的缺失）独立于与POD24相关的FLIPI和驱动基因（HIST1H1D）突变状态，并与较差的PFS显著相关（P<0.05）。这些变异与PFS相关性的Kaplan-Meier曲线见图4A-D。既往的研究表明，治疗对POD24有显著影响。对本研究最初纳入的415例患者和进行全外显子组测序的102例患者进行分析后发现，治疗并不是POD24的显著风险因素。造成这一结果的原因可能是纳入患者的偏倚。该队列中的大多数患者都接受了R-chemo方案一线治疗，而接受其他治疗方案的患者较少。为防止偏倚，对接受R-chemo治疗的患者进行的生存分析表明，所有4种变异（驱动基因突变和CNA）也与较差的PFS显著相关。整合CNA和驱动基因突变状态后发现，在76%的POD24患者中同时存在4种变异（HIST1H1D突变、6p22.2和18q21.33增益以及1p36.13缺失；图4E）。然而，在本研究队列中，m7-FLIPI鉴定POD24的敏感性和特异性分别只有56%和41%。
图4. CNA和突变与FL至进展时间的相关性
POD24和non-POD24 FL样本的基因表达分析
接下来，研究人员对41个FL样本（POD24，11个；non-POD24，30个）的转录组进行了特征分析。与non-POD24亚型相比，在POD24亚型中观察到了独特的基因表达谱，包括一组上调基因（n=434），如MME、CXCR1、CD5L、HLA-G、IL27、ZNF365和几个主要组织相容性复合体Ⅰ类（MHC Ⅰ）分子相关基因，以及一组下调基因（n=840），如CCND1、CXCL8、TP73和组蛋白家族成员基因（图5A）。利用GSEA程序，研究人员根据共同的生物学功能、染色体位置或基于MSigDB的调控对基因集进行了聚类。如图5B所示，分析表明POD24亚型明显富集于主要与炎症反应（由干扰素和肿瘤坏死因子介导）、细胞周期调控（转录、复制和增殖）和PI3K-AKT-mTOR信号传导有关的基因集中。
图5. POD24的FL患者显示出独特的基因表达模式
与POD24相关的细胞异质性和肿瘤标志性信号的演变
为了进一步验证批量RNA-seq数据的结果，对6例FL患者的肿瘤样本进行了scRNA-seq分析（图6A-C）。在39460个测序细胞中，33940个（86.01%）通过了质量过滤，每个细胞的中位基因数为1890个。研究人员进行了降维分析（t-SNE，t-分布随机邻居嵌入）和无监督聚类，根据典型标志物的表达对细胞进行分类（图6D）。总共鉴定出了19712个恶性B细胞（58.08%）、3311个肿瘤浸润B细胞（9.76%）、8611个T细胞（25.37%）、1823个单核吞噬细胞（MP）（5.37%）、206个自然杀伤（NK）细胞（0.61%）、95个浆细胞样树突状细胞（pDC，0.28%）和182个基质细胞（0.54%）。此外，根据患者和治疗反应（POD24和non-POD24；图6C）的不同，恶性B细胞也被区分开来，这表明肿瘤细胞间存在高度异质性，正如在其他癌症中观察到的那样。为了评估肿瘤细胞间的异质性是否会影响肿瘤标志物的表现和单细胞分辨率下的早期进展，研究人员评估了由MSigDB编辑的50个肿瘤标志物基因集的通路活性，并分析了与POD24相关的肿瘤标志物的转录组异质性。
总体而言，25个癌症标志基因在早期进展患者（POD24队列）的FL细胞中明显上调，包括IFN-γ反应、PI3K/AKT/mTOR、DNA修复、细胞周期和mTORC1信号传导（图6E）。上述结果与批量RNA-seq结果一致，进一步证实了单细胞分辨率分析的结论。总之，本研究数据展示了FL患者的单细胞景观，并证实了这些肿瘤标志物在早期进展中的重要作用。
图6. 在单细胞分辨率下癌症标志的转录组异质性与P0D24相关
总结
对患者进行风险分层以识别高风险患者对于临床试验设计和一线治疗的实际临床决策都尤为重要。此外，避免对低危患者过度治疗，优先考虑替代治疗方案而非高危患者的标准治疗也很关键。临床预后标志物和分子学特征可部分预测FL的预后，但仍需更多信息来识别高危患者，尤其是那些可进行干预的生物学因素。整合基因组研究使人们对FL疾病的发生、发展和转化机制有了全面的了解，并有助于建立风险模型来预测FL患者的预后。包括本研究在内的多项既往研究表明，与西方国家相比，中国的DLBCL、NK/T细胞淋巴瘤和FL患者存在独特的体细胞突变特征。
在此，张会来教授团队研究了415例TMUCIH FL患者的临床特征，并采用NGS技术对102例样本进行了全面的基因组和转录组分析，以探索早期进展患者的潜在遗传机制。存在B症状、乳酸脱氢酶和β2-微球蛋白水平升高、基线血红蛋白不佳、晚期和高危FLIPI评分的患者发生POD24的风险增加，其中FLIPI评分是预测POD24最重要的临床变量。在对CNA和驱动基因突变进行的基因水平分析中，发现了5个染色体区域和1个驱动基因与POD24相关。此外，有3个CNA显示出一定的预测价值，但与FLIPI无关。除CNA外，本研究还强调了驱动基因突变在疾病进展中的潜在重要性。在已发现的基因中，HIST1H1D基因突变在POD24患者中更为普遍（17.2% vs. 4.1%），并且与PFS相关。
总体而言，本研究是第一项与FL患者POD24相关的全面基因组和转录组学研究，发现POD24的FL患者具有不同的临床、遗传和分子学特征。本研究中发现的基因改变可能为开发新型治疗策略提供机会。然而要确定和验证这些肿瘤中的候选驱动基因和CNA，还需要对更大样本量的POD24 FL患者进行进一步研究。
Gao FH, Liu HQ , Meng XR,et al. Integrative genomic and transcriptomic analysis reveals genetic alterations associated with the early progression of follicular lymphoma.Br J Haematol . 2023 Jul 16. doi: 10.1111/bjh.18974.
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