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【中国好声音】《自然》子刊：中国科学家突破CAR-T生产瓶颈！武汉大学中南医院团队改进CAR-T生产方法，效率提升20倍，抗癌活性也大幅提高

2023年08月02日

来源：奇点网

近几年，新型抗肿瘤疗法英雄辈出，但其中诸如免疫检查点抑制剂已经得到了广泛的应用，而嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）却没有得到同等待遇。
CAR-T在实体瘤上的疲软是一方面，另一方面，CAR-T制备流程之复杂困难也是巨大的障碍。CAR-T制备过程中，如何安全有效地转染基因是一大问题，T细胞对DNA转染耐受很低，使得转染后实际存活的细胞并不多，大大降低了生产效率。
近期，武汉大学中南医院团队提出了解决问题的新方法，研究者们发现，电穿孔转染DNA的毒性是由cGAS-STING途径介导的，而改变使用的缓冲液渗透压能够显著抑制这一过程，将生产CAR-T的效率提升20倍，生成的CAR-T细胞抗肿瘤活性也高于传统慢病毒方法。该论文发表在《自然·生物医学工程》上[1]。

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论文概述

目前市面上以及临床试验中使用的大多数CAR-T细胞，都是使用慢病毒载体递送基因的。但是慢病毒载体存在随机基因组整合问题，这既影响目标基因的表达，也带来了潜在的致癌风险。

新的腺相关病毒（AAV）载体虽然能够一定程度上提升CAR-T细胞的抗肿瘤效果，但是它也更加昂贵、复杂、耗时长，而且病毒基因整合的安全问题仍然存在。

不使用病毒的递送方法更加快捷经济，不过在过去几十年中，经验告诉我们，T细胞面对DNA转染是很脆弱的，电穿孔诱导的质粒DNA转染会导致T细胞大量死亡。如果搞清楚这个过程中T细胞到底受了什么伤，是否能让它们变“坚强”？

研究者们将目光放到了环GMP-AMP合成酶（cGAS）身上，它是细胞质中双链DNA（dsDNA）的关键传感器，cGAS的激活会通过STING蛋白激活干扰素依赖的免疫反应，并导致细胞死亡。有趣的是，当研究者们从人或小鼠T细胞中敲除cGAS或STING，发现这确实能够阻止DNA诱导的细胞死亡。但是小鼠的STING抑制剂表现出明显的边际效应，而人的STING抑制剂H151不能挽救细胞死亡。

图1 STING抑制剂H151不能挽救细胞死亡

使用小干扰RNA（siRNA）倒是能够预防DNA转染诱导的STING激活，但是递送siRNA又需要一次电穿孔，这是T细胞承受不了的。研究者们的思路可以说是非常开阔。由于cGAS只在细胞质中反应，因此另外一种策略就是令转染DNA快速进入细胞核、减少在细胞质中的留存时间。

研究者们筛选比较了数百种电穿孔缓冲液和参数设置的组合，并找到了能够最大程度上抑制cGAS-STING通路活性的一组。BO14缓冲液和EO138程序的组合比常用的商业设置P3缓冲液和EO115程序，能够表现出更好的递送效率。BO14-EO138的核定位效率为84.6%，P3-EO138则为69.5%。

图2 BO14-EO138的核定位率更高

对缓冲液成分进行详细分析后，研究者调整缓冲液比例后的B1mix能够进一步提升敲入效率，同时保证T细胞活力。

原来，电穿孔缓冲液的渗透压在介导cGAS与DNA结合上有重要作用，能够影响下游2'3'-cGAMP的产生和STING激活。调整缓冲液渗透压后，电穿孔制备CAR-T细胞数量比慢病毒递送要多20倍，CAR-T的抗肿瘤杀伤性也更强。

图3 新方法产生的CAR-T细胞绝对数量是对照的20倍

此外，值得一提的是，研究者们实验中使用的DNA递送量非常低，每次仅有1-3μg，是之前同类实验的1/3-1/2，仍能够产生足够的CAR-T细胞，这无疑能够大大简化制造流程。

研究者还尝试在治疗相关的人类造血干细胞等其他细胞类型中进行了实验，发现调节缓冲液渗透压都能提升转染效果。改变缓冲液条件和程序设置就能这么大幅度地提升转染效率，可以说是情理之中但意外之喜了~相信这些巧思能够加速CAR-T迈向“更好更快更便宜”，赶快为大众所用！

参考文献

An, J., Zhang, CP., Qiu, HY. et al. Enhancement of the viability of T cells electroporated with DNA via osmotic dampening of the DNA-sensing cGAS–STING pathway. Nat. Biomed. Eng (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01073-7

排版编辑：Luna

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