获得性再生障碍性贫血（AA）被认为是一种免疫介导的造血疾病，由效应T淋巴细胞主动破坏骨髓（BM）中的造血细胞引起。高通量基因组分析及转录组测序的应用有助于更好地了解与造血系统破坏发病相关的复发性细胞遗传学异常和免疫学线索。然而，异质性T淋巴细胞群复杂性背后的功能机制决定因素及其与临床结果的相关性仍有待阐明。
为了揭示异质性骨髓浸润免疫环境中的功能障碍机制，并研究其与造血干/祖细胞库的致病性相互作用。近期，中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）竺晓凡教授/张英驰教授团队在国际知名免疫学期刊Journal of Autoimmunity杂志发表相关研究，他们利用单细胞流式细胞术对重型AA（SAA）患者在免疫抑制治疗（IST）前后的BM单核细胞（BMMC）进行了检测，并与健康供体（HD）的单核细胞进行了对比。结果显示，高血浆IL-6水平是对基于抗胸腺细胞球蛋白的免疫抑制治疗产生延迟造血反应的独立危险因素。因此，IL-6可作为SAA的一个潜在的治疗靶点，值得进一步研究。
为了探索在诊断和治疗后阶段的儿童SAA患者BM中的细胞组成变化[热休克蛋白（HSPC）和成熟细胞]，研究人员进行了质谱流式技术（CyTOF）分析。比较了9个来自诊断时的SAA样本（Dx-SAA）、3个IST后的SAA样本（post-IST-SAA）和4个来自儿童HD的BMMC样本（图1A）。预定义的标记组，专门设计用于表征BMMC的组成和功能，包括关键表面抗体（n=31）和针对关键蛋白激酶磷酸化形式的抗体（n=11）。总的来说，对来自超过8,321,000个BMMC的再处理数据通过降维算法t分布式随机邻居嵌入（t-SNE）进行了聚类和可视化（图1B）。
进行基于典型谱系标志物表达的细胞类型注释（图1C）以将原始50个簇划分为8个主要功能类别，即干细胞/祖细胞、粒细胞、红细胞和免疫亚群（单核细胞、树突细胞、B细胞、T细胞和NK细胞）（图1D）。
分批t-SNE图显示了每个类别的特征基因的表达水平（图1E）。随后，研究人员进一步将处于不同阶段的SAA患者与健康对照组的细胞谱进行了比较，并观察到Dx-SAA样本中显著改变的BMMC分布（图1F）。值得注意的是，与post-IST-SAA和HD样本相比，Dx-SAA样本中所有非免疫细胞亚群以及免疫细胞亚群中单核细胞和树突细胞的比例显著降低，而T细胞的比例显著升高。这些变化可能与AA的免疫介导的病理生理学机制有关（图1G）。
图1. 在Dx-SAA、post-IST-SAA和HD样本中对BMMC组分进行深入表征
Dx-SAA患者T细胞亚群中的免疫组分倾斜可区分不同的CD4+ naïve T细胞表型
为了更详细地了解SAA发病时潜在活性T细胞亚群的免疫状况，研究人员将CD3+ T细胞亚群进行了重新聚类，以分析各亚群的组成差异。在T细胞谱系发育期间使用充分建立的标志物来区分CD3+ T细胞亚群揭示了27个重新聚集的亚群，其在表型上对应于四种主要细胞类型：CD 4+、CD8+、γ/δ Τ（gdT）和双阴性T（DNT）细胞。从病程的角度检查该组成，发现与HD和post-IST-SAA样本相比，Dx-SAA样本中CD4+ T细胞显著增加（P ≤ 0.01），而gdT细胞显著减少（P≤ 0.001）。这表明Dx-SAA样本中增加的T细胞部分是由充分活化的CD4+ T细胞亚群引起的（图2）。值得注意的是，在最初50个聚类的11个CD4+ T细胞亚聚类中，亚聚类26和27（C26和C27）在Dx-SAA样本中占总T细胞群体的细胞比例显著高于HD样本，但在IST治疗后减少（P≤0.001）。
基于CyTOF信号以及来自本回顾性队列的流式细胞仪验证，在这些亚群中鉴定出相对高水平的CD45RA和CCR7表达，表明在Dx-SAA样本中的CD3+ CD4+ BMMC亚群中有较高比例的naïve T细胞。 此外，与其他细胞群相比，这些细胞中NFκB（pNFκBS529）和STAT3（pSTAT3Y705）的磷酸化水平高得多。
总之，这些结果表明，具有不同表型的非典型CD4+ naïve T细胞亚群可能与SAA发病机制相关。
图2. 三个样本组中四种不同T细胞亚群
通过scRNA-seq鉴定SAA中与CD4+ CAMK4+ naïve T细胞相关的推定调节因子
为了进一步阐明不同的CD4+ naïve T细胞在儿童AA中的确切作用，研究人员对来自五例上述Dx-SAA和2例HD中分离的CD3+ BMMC进行了高通量基于液滴的5′-单细胞RNA-seq （scRNA-seq）和配对T细胞受体测序（scTCRseq）（图3）。
随后，采用基因标记将20个亚簇功能性分类为14种T细胞谱系细胞类型。有趣的是，具有最高水平的CCR 7表达的亚群被鉴定为表达高水平的钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IV（CAMK4）的CD4+ naïve T细胞。与CD4+效应细胞一起，发现它们是所有SAA样品中最显著增加的T细胞部分。 
图3. 单细胞转录组分析（基于高通量液滴的scRNA-seq和scTCRseq）的示意性工作流程
由于转录因子被认为是造血谱系定型和特异性的关键决定因素，研究人员继续检查关键转录因子在14种T谱系细胞类型中的表达（图4A）。几种转录因子的表达，包括RUNX1、STAT3、IKZF1、MEF2A和ATF6，在CD4+CAMK4+ naïve T细胞和CD4+效应T细胞中明显高于其他T细胞区室。相反，其他转录因子的表达，包括ENO1、TAF7和YBX1，在这两个CD4+细胞群中较低（图4B）。
图4. 通过对Dx-SAA和HD样本进行单细胞转录组分析，确定T淋巴细胞亚群中独特的调节网络活性
对SAA患者CD4+ T淋巴细胞功能异常进行研究
分析表明Dx-SAA中CD4+ T细胞的分化轨迹与HD样本中的相似。尽管如此，与HD CD4+ T细胞相比，在Dx-SAA CD4+ T细胞中观察到CD4+ CAMK 4+ naïve T细胞的显著增加，支持SAA中CD4+ CAMK 4+ naïve T细胞与失调的CD4 + T淋巴细胞特征之间的推定相关性。
为了进一步确定非典型CD4+ naïve T细胞超活化的分子基础，研究人员通过在Dx-SAA样本中的CD4+ CAMK 4+ naïve T细胞和典型CD4+ CAMK4- naïve T细胞之间，以及在SAA样本中的CD4+ CAMK4+ naïve T细胞或CD4+效应细胞与HD中的相同区室之间进行成对比较来评估转录组学改变。这些比较分别产生598、559和325个差异表达的基因（P≤0.05）。
值得注意的是，代表信号通路的关键基因，如选择性剪接体调节子（SF3B1、DDX5、FUS）、TCR信号传导基因（ITK、PTPRC、ZAP70）和Th17细胞分化基因（JAK3、STAT3、IL6ST）在CD4+ CAMK 4+ naïve T细胞中一致地持续超活化。当比较SAA和HD样本中的CD4+效应细胞时，观察到了类似的趋势，表明SAA中的CD4+ T辅助细胞区室中的总体活化和潜在的Thl 7极化（图5）。、
与这一发现一致，来自30例Dx-SAA和23例HD的CD4+ BMMC中STAT3pY705和STAT3pY727的磷酸化流式细胞术分析强烈暗示了发生SAA时Th17极化的CD4+ naïve T细胞中JAK3/STAT3途径的异常激活。
图5. 热图分层显示了1）CD4+ naïve 和CD4+ CAMK 4+ naïveT细胞；2）HD和Dx-SAA的CD4+ CAMK 4+ naïveT细胞；3）HD和SAA的CD4+效应T细胞之间的代表性差异表达基因
高水平的基线血清细胞因子IL-6可预测SAA患者对IST的延迟造血反应
根据CD4+ T辅助细胞的个体发生研究，IL-6是诱导STAT 3活化的Th17细胞从CD 4+ naïve T细胞分化的关键刺激物。因此，研究人员试图通过研究231例儿童SAA患者中IL-6水平与预后之间的关系来阐明SAA中基线IL-6水平的临床意义。
所有患者均接受联合兔源抗胸腺细胞球蛋白（ATG）和环孢菌素的IST方案。中位随访时间为69个月，在213例疗效可评估患者中，IST后3、6、9和12个月的总缓解率为18.6%（n=43）、34.3%（n=79）、51.6%（n=110）和60.6%（n=129）。
此外，血清IL-6水平较高（≥120 pg/ml）的患者似乎表现出较晚的总体应答（尽管无统计学显著性；P=0.348）。特别是，纳入与IST应答相关的假定因素（包括年龄、性别、诊断严重程度、病程、ATG剂量和初始三线血细胞计数以及基线IL-6水平）的多变量分析一致地证实了IL-6 ≥ 120 pg/ml是导致IST治疗不敏感和粒缺恢复时间延长、脱离红细胞和血小板输注时间延长等远期反应不良标志的独立危险因素。
总结
总体而言，本研究结果阐明了在SAA免疫介导的造血功能衰竭中不同的骨髓浸润T细胞区室的功能作用。通过定制scRNA-seq和CyTOF分析工具，在单细胞转录组和蛋白质组水平上解读自身免疫的分子决定因素，可以发现CD4+ CAMK4+ naïve T细胞IL6/JAK3/STAT3的激活及潜在的Th17极化是SAA免疫失衡的重要分子机制之一。因此，这项研究提供了对SAA中BM免疫机制的理解，并强调激活的JAK3/STAT3是一个潜在的治疗靶点，值得进一步研究。
Jingliao Zhang, Tianfeng Liu, Yongjuan Duan, et al; Single-cell analysis highlights a population of Th17-polarized CD4+ naïve T cells showing IL6/JAK3/STAT3 activation in pediatric severe aplastic anemia;Journal of Autoimmunity 136 (2023) 103026.https://doi.org/10.1016/j.jaut.2023.103026.
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