急性T淋巴细胞白血病（T - ALL）是一种侵袭性恶性肿瘤，患者的预后不佳，约25%的儿童及40%的成年T - ALL患者在短暂初始缓解后出现原发性耐药或复发。而白血病干细胞（LSC）与白血病起始、治疗失败和疾病复发相关，因此，识别和根除LSC为白血病提供了治疗机会。但当前缺乏LSC的标志物，尚不清楚LSC的有效治疗方式。
PD-1和PD-L1是维持免疫耐受的基本免疫检查点机制，其中，PD-L1在肿瘤细胞和肿瘤相关抗原提呈细胞上的表达可以抑制表达PD -1的T细胞以实现免疫逃逸。基于此，抗PD-1和抗PD-L1抗体疗法治疗实体肿瘤显示出实质性的临床疗效（尽管仅适用于特定肿瘤类型的小部分患者）。此外，PD-1在活化的T细胞中表达上调，以调节其活化和衰竭。然而，目前尚不清楚PD-1在T - ALL中的作用。
值得庆幸的是，近期，中山大学赵萌/蒋琳加教授团队发现PD-1是T - ALL中LSC的决定性标志物，还探索了抗PD -1靶向LSC治疗T - ALL的可行性和机制，并将相关结果于近日以封面文章的形式发表于Nature Cell Biology杂志。肿瘤资讯特将该研究结果进行整理，以飨读者。
研究结果
PD-1可在T - ALL中标记LSC
≥60%的T – ALL患者会出现NOTCH1（配体激活的转录因子致癌基因）的过度激活突变。在小鼠模型中，活化的NOTCH1转导到骨髓（BM）造血祖细胞有效地驱动T - ALL，这些模型被称为T-ALL小鼠模型（图1a）。使用这种T-ALL小鼠模型，研究者发现PD-1+细胞在绿色荧光蛋白阳性（GFP+） T - ALL细胞（GFP在逆转录病毒载体中与NOTCH1一起表达）中只占小部分（1~2%）（图1b）。
图1. a. 描述NOTCH1诱导的T - ALL小鼠模型的生成和PD-1-和PD-1+ T-ALL细胞白血病启动能力的定量示意图；b. PD-1-和PD-1+ T-ALL细胞移植后6周的代表性FACS图（n = 5只小鼠）
为了评估PD-1在T - ALL中的作用，该研究使用纯化的PD-1+和PD-1- T - ALL细胞进行了限制性稀释试验。单个PD-1+ T - ALL细胞可在受者中引发白血病，白血病引发细胞频率为1 / 1.84。相反，PD-1-白血病细胞在受体中引发白血病的能力要低得多(1 / 9,356)。
图2.接受指定数量的PD-1-或PD-1+ T-ALL细胞（左）和PD-1-或PD-1+ T-ALL细胞竞争性繁殖单位（右）的T-ALL小鼠的生存曲线（每组n = 5只小鼠）
该研究进一步开发了Pdcd1creErt2；以及Rosa26-tdTomato（Pdcd1creErt2；Tdtomato）条件报告小鼠，即经他莫西芬诱导后在PD1+细胞及其子代细胞中表达番茄红标志物（图3上）。值得注意的是，单个PD-1+细胞在96小时内进行了大量白血病克隆（图3下）。
图3. PD-1+ T-ALL细胞及其子代的活体成像示意图（上）；植入Pdcd1creErt2；tdTomato T-ALL细胞的受者的颅骨延时活体显微镜图像（下）
与之相反，在疾病进展过程中，PD-1+ T - ALL细胞在BM中表达GFP的T-ALL细胞中保持稳定（1~2%）（图4）。
图4. 谱系追踪实验的实验设计示意图、代表性FACS图（f）；骨髓中PD-1+ T-ALL细胞及其子代细胞的频率（g）
PD-1+ LSC具有耐化疗性并能更新T – ALL原始细胞
移植后三周，PD-1+细胞比PD-1-细胞产生更多的T - ALL细胞。值得注意的是，PD-1+ LSC自我更新并产生PD-1-子代，而PD-1- T - ALL细胞在受体中不能产生PD-1+ LSC，即使在T – ALL疾病后期也是如此。
图5. 移植后3周后，使用PD-1+和PD-1- T - ALL细胞进行移植的策略和代表性FCAS图，以及来自受体T - ALL细胞的BM（n = 5只小鼠）（a）；移植3周后，接受PD-1+或PD-1- T - ALL细胞的受者骨髓中GFP+ T – ALL细胞中PD-1+细胞的频率（每组n = 5只小鼠）（b）
该研究还探索了PD-1+ T - ALL细胞在化疗应答中是否具有优势。为此，研究者在他莫昔芬治疗后立即用L-天冬氨酸、地塞米松和长春新碱联合化疗治疗植入Pdcd1creErt2；Tdtomato T - ALL细胞的小鼠（图6c）。结果显示，联合化疗治疗可有效消除BM中的PD-1- T - ALL细胞，但保留PD-1+ LSC（图6d）。存活的PD-1+ LSC自我更新并产生T - ALL细胞（番茄红GFP细胞）并最终导致疾病复发（图6e）。
图6. L-天冬氨酸、地塞米松和长春新碱联合化疗后PD-1+ T-ALL细胞应答谱系追踪策略示意图（c）；在移植后的指定时间接受他莫西芬和化疗的GFP+ PD-1- T - ALL细胞和GFP+ PD-1+ T-ALL细胞在T - ALL BM中的代表性FACS图（左）和定量图（右）（每组n = 4只小鼠）（d）；在他莫西芬移植和化疗治疗后（每组n = 4只小鼠），植入Pdcd1creErt2的T-ALL受体骨髓中GFP+ T - ALL细胞和GFP+ 番茄红- T - ALL细胞的代表性FACS图（左）和定量（右）（e）。
T – ALL中，PD-1是白血病发生所必需的
在T-ALL中，为了进一步研究PD-1+细胞是否为发生白血病所必需的，研究者生成了Pdcd1creErt2；DTA系，其中自杀基因催化白喉毒素片段A（DTA）通过他莫西芬诱导在PD-1+ T - ALL细胞中诱导消融PD-1+ LSC（图7a）。
与接受对照T - ALL细胞的受者相比，五次他莫西芬注射有效地消融了接受Pdcd1creErt2；DTA T - ALL细胞的受者骨髓中的PD-1+ T-ALL细胞，在他莫西芬治疗后，T - ALL小鼠持续表达PD - 1的正常T细胞（图7b）。消融PD-1细胞显著降低了PB小鼠的疾病负担，提高了T - ALL小鼠的存活率（图7c，d）。
该研究还使用PD-1敲除（Pdcd1 - / -）小鼠来研究PD-1信号通路在T - ALL中的作用（图7g）。结果显示，T - ALL细胞中Pdcd1的缺失降低了原发T - ALL小鼠的疾病负担并延长了生存期（图7h - j）。值得注意的是，缺失pdcd1的T-ALL细胞在次级受体中严重丧失了疾病传播能力，这可以从PB（图7k）、脾脏（图7l）和BM（图3m）的疾病负担减轻中反映出来。这些影响反过来又延长了总生存期（图7n）。此外，T - ALL细胞的Pdcd1缺失消除了PB、BM和其他器官的疾病负担（图7o - r），并使B - NDG受体的总生存期延长（图7s）。
图7. T – ALL中，PD-1是白血病发生所必需的
PD-1可以识别人T - ALL中的LSC
该研究从移植的人体T - ALL细胞中纯化PD-1+和PD-1-细胞，以获得它们的白血病启动能力（图8a）。结果与使用小鼠模型获得的结果一致：将相同数量（10,000个细胞）的PD-1+或PD-1-人CD3+ T - ALL细胞移植到B - NDG受体中时，PD - 1细胞始终推动更强劲的疾病进展，包括PB、BM和其他器官的疾病负担（图8b - d）。PD-1+ LSC自我更新并产生PD-1-大块白血病细胞，而PD-1- T - ALL细胞不能在受体中产生PD-1+ LSC（图8e）。此外，在两个独立的PDX实验中，接受人PD-1+ LSC的小鼠比接受人PD-1- T - ALL细胞的小鼠的总生存率降低（图8f）。限制性稀释试验结果也显示，在3例T - ALL患者中，PD-1+细胞明显富集了更多的白血病启动细胞（图8g - i）。
图8. PD-1可以识别人T - ALL中的LSC
T-ALL中，表达PD -1的LSC的特征
小鼠中，与PD-1-细胞相比，PD-1+细胞表现出不成熟的形态，如体积更小，细胞与核的比例更低，粒度更小（图9a，b）。通路分析显示，与PD-1-细胞相比，PD-1+ LSC上调MYC通路、白血病干细胞和早期T细胞祖细胞发育相关基因，下调凋亡、细胞周期和PI3K - AKT信号通路相关基因（9c，d）。与T - ALL小鼠中PD-1-细胞相比，PD-1+细胞在细胞周期中处于静止状态（图9e），具有低活性氧（ROS）水平（图9f）和减少的诱导凋亡（图9g，h）。
在T- ALL小鼠中，与PD-1-细胞相比，PD-1+细胞富集早期T淋巴细胞基因，并表达高水平的IL-7Rα（图9I，j）。
转录分析显示，PD-1+ T - ALL细胞表现出增强的NOTCH1信号通路和MYC活性（图9k）。与此相关，与PD-1- T-ALL细胞相比，PD-1+ T - ALL细胞的MYC、NOTCH1和NOTCH1胞内结构域（NICD1）表达增加（图9l）。此外，RBP-Jk在PD-1+ LSC中结合Pdcd1启动子，但在T - ALL小鼠的PD-1-白血病细胞中没有结合（图9m）。事实上，在T - ALL小鼠的PD-1-白血病细胞中，NOTCH1的过表达以RBP - jk依赖的方式上调了PD-1（图9n，o）。
图9. T-ALL中，表达PD -1的LSC的特征
PD-1信号通路保护LSC免受TCR诱导的凋亡
在BM中，T- ALL细胞以及胸腺中未成熟的CD4+ CD8+ T细胞比CD3+成熟T细胞表达更高水平的T细胞受体β（TCRβ）（图10a）。该研究的转录谱分析显示，PD-1-细胞比PD-1+细胞富集更多TCR诱导的负选择特征基因（图10b）。同样，TCR下游AKT信号在PD-1-白血病细胞中高于PD-1+ LSC（图10c）。为此，该研究同时用抗CD3和抗CD28抗体处理PD-1+和PD-1-细胞，以刺激TCR的激活（图10d）。与PD-1+ LSC相比，PD-1- T - ALL细胞具有更高的TCR激活，ERK信号的瞬时激活（图10e）和凋亡（图10f）证实了这一点。
然后该研究在T - ALL小鼠中探索PD-L1。多种类型细胞（包括正常的造血细胞、基质细胞和T - ALL细胞）在T - ALL小鼠的骨髓中产生PD-L1（图10i）。为了探索PD-L1对PD-1+细胞的作用，该研究从T - ALL小鼠中纯化了PD-1-、PD-1+ PD-L1-和PD-1+ PD-L1+ T - ALL细胞，并对其进行TCR激活刺激（图10j）。值得注意的是，TCR的激活有效地引发了PD-1-和PD-1+ PD-L1- T - ALL细胞的凋亡，但在具有自分泌PD-L1的PD-1+ PD-L1+ T - ALL细胞中却没有。此外，给予PD-L1可保护PD-1+ PD-L1- T - ALL细胞免受TCR诱导的细胞死亡（图10k，l）。与此一致，在PD-1+ LSC中，自分泌或给予PD-L1抑制TCR激活及后续细胞死亡，但在PD-1-白血病细胞中不会发生此种情况（图10k，l）。在人T - ALL细胞中也观察到PD-L1的表达（图10m）。与小鼠T - ALL一致，PD-L1的自分泌或给药抑制了PD-1+人T - ALL细胞中TCR的激活和后续细胞死亡（图10n，o）。
图10. PD-1信号通路保护PD-1+ LSC对抗TCR诱导的细胞凋亡
PD-1阻断是治疗T-ALL的有效方法
在小鼠和人T - ALL细胞中，即使在PD-L1存在的情况下，PD-1阻断也能有效地诱导PD-1+细胞凋亡（图11a）。PD-1阻断T - ALL小鼠也能有效降低PB、脾脏和肝脏的疾病负荷（图11b，c），并延长其总生存期（图11d）。PD-L1阻断可重复观察治疗效果，减少了PB和其他器官的疾病负荷（图11e，f），延长了T - ALL小鼠的生存（图11g）。此外，PD-1阻断联合化疗治疗T-ALL小鼠延长了小鼠的生存期（图11h - j）。联合治疗比PD-1阻断剂单药或单独化疗更有效地延长了人T - ALL细胞B - NDG受体的生存期（图11k - m）。
图11. PD-1阻断是治疗T - ALL的有效方法
研究结论
综上所述，该研究提供了分子、细胞和体内功能证据，证明PD-1是T - ALL的决定性LSC标记物。该研究还确定了白血病细胞的层次结构以及有前景的治疗方案：使用化疗联合PD-1——PD-L1阻断剂治疗T - ALL。
Xi Xu, et al. PD-1 signalling defines and protects leukaemic stem cells from T cell receptor-induced cell death in T cell acute lymphoblastic leukaemia. Cell Biol. 2023 Jan;25(1):170-182.
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