感染是异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）后非复发死亡的主要原因，这与移植后供体来源的免疫重建延迟密切相关。目前，关于如何定量评估HSCT后的免疫重建并将其作为护理标准的一部分尚未形成共识。
近日，中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）陈俊仁教授、干细胞移植中心姜尔烈教授、儿童血液病诊疗中心郭晔教授和中国科学技术大学第一附属医院孙自敏教授作为共同通讯作者于American Journal of Hematology（IF=13.268）发表相关研究成果。该研究以免疫重建的“细胞计数恢复”方面为研究对象，回顾性分析了2012~2020年，在我国两个医疗机构中接受HSCT的1945例患者的移植后多维时间序列免疫数据，其中1838例（94.5%）患者接受了allo-HSCT。研究人员利用无监督的机器学习来可视化免疫重建的时间进程。此外，还确定并验证了移植后第91~180天的综合免疫标记来预测allo-HSCT的早期死亡率。
研究背景
HSCT后的免疫重建在不同患者中差异很大，这种差异会影响预后。CD4+ T细胞计数被认为是HSCT后患者预后的临床预测指标。另有研究人员报道，自然杀伤（NK）细胞和原血细胞的早期重建或“健康”多元免疫状态的早期获得可以预测移植后更好的存活率或更低的并发症发生率。此外，干细胞的来源和预处理方案都会影响免疫重建的速度。
然而，由于患者的高度异质性和总体样本量较小，目前很难总结所有已发表的关于移植后免疫重建的文献。既往研究通常未对其主要结果进行独立验证，此外，还经常受到人群规模较小（少于200例患者）或免疫分析持续时间较短（≤1年）的限制。而且，除特殊情况外，研究人员在评估患者的免疫重建时，往往不会整体评估多个免疫变量；换句话说，目前对于如何对患者的多时间点和多变量免疫数据进行评分，还没有形成共识。
研究方法
本研究回顾性分析了2012~2020年在中国医学科学院血液学研究所（IHCAMS）接受HSCT的1245例成人患者、2017~2020年在IHCAMS接受HSCT的76例儿童患者，以及2015~2019年在中国科技大学第一附属医院（FAHUSTC）的624例患者，即共1945例患者的移植后多维时间序列免疫数据——以下称为“SKIRT”（Systems Kinetics of Immune Reconstitution Tianjin）数据集。
IHCAMS患者临床结局随访的最后一天为2022年5月16日，FAHUSTC患者的为2022年4月25日。本研究中的“免疫特征”包括外周血的20个临床特征，包括全血细胞计数的6个特征（白细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞计数）、来自多参数流式细胞术（使用单克隆抗体组合CD3/CD4/CD8/CD16/CD19/CD25/CD56/CD127）的8个特征（有核细胞中的单核细胞和淋巴细胞百分比；NK、total T、CD4+ T、CD8+ T、Treg和淋巴细胞中的B细胞百分比），以及来自“免疫特征”中的其他6个特征（NK、total T、CD4+ T、CD8+ T、Treg和B细胞计数）。
为防止过度拟合，SKIRT中的allo-HSCT受者被分为3个不同的非重叠子集：2019年1月1日前（不包括）IHCAMS中的729例患者构成了训练集，2019年1月1日后IHCAMS中的485例患者构成了验证集，FAHUSTC的所有624例患者构成了试验集。
研究结果
SKIRT包含来自1945例患者的11,150个移植后免疫特征，每例患者在移植后60天后具有≥1个免疫特征[范围，1~18；第25百分位数（Q1），2；第75百分位数（Q3），6]。
1945例患者中有585例（30.1%）在移植后2年有免疫分析数据。移植后免疫分析的中位持续时间为1.3年（范围：0.2~7.7；Q1，0.7；Q3，2.1），临床结局随访的中位持续时间为2.7年（范围：0.2~8.9；Q1，1.4；Q3，4.3）。
在群体水平上，脐血（UCB）allo-HSCT的CD8+ T细胞计数上升速度慢于其他类型HSCT。相反，UCB allo-HSCT的NK、CD4+ T和B细胞计数最终达到高于其他类型移植的水平（图1）。auto-HSCT的NK细胞计数的增加速度慢于其他类型的移植（图1）。
图1.移植后免疫重建的人群水平单变量统计
为了在人群水平上超越单变量描述性统计，研究人员将11,150个免疫特征嵌入到二维“相空间”上（图2A，B）。可以发现，沿着二维“相空间”的横轴，表型梯度主要限于CD8+ T细胞计数；相反，沿着纵轴，大多数免疫细胞计数存在广泛的梯度（图2C）。因此，研究人员将横轴称为“CD8重建”轴，纵轴称为“广泛重建”轴。
平均而言，在移植后的最初两个月内，免疫重建沿着CD8重建轴（即从左到右）进化，随后沿着广泛重建轴（即从下到上）进化（图2D）。将免疫数据嵌入到二维平面上，使研究人员能够比较免疫重建的个体轨迹。免疫状态的患者间差异在移植后约第60天达到峰值，之后，患者逐渐变得更加一致（图 2D ）。
然后，研究人员还研究了当患者偏离免疫重建的平均轨迹时是否产生任何临床结果。换句话说，是否存在任何与移植后总生存期高度相关的免疫重建的时间依赖性特征（图2A）。在随后的分析中，研究人员重点研究了allo-HSCT。
图2.可视化移植后免疫重建的轨迹
对于4个移植后时间段（即第1~90天、第91~180天、第181~270天和第271~360天）中的每一个时间段，研究人员在训练集中使用10倍交叉验证方法检测是否存在预测死亡率的综合免疫标记。在训练集中，“第91~180天”和“第271~360天”均达到统计学显著性差异（P<0.05）。然而，在训练集和验证集中，只有第91~180天的综合免疫标记具有统计学显著性差异（P<0.05）（图3A，B）。需要注意的是，729例训练集患者中只有514例（70.5%）在第91~180天有可用的免疫特征数据，485例验证集患者中只有284例（58.6%）在第91~180天有可用的数据。在第91~180天具有免疫分析数据的患者亚组的临床病程与训练集
中和验证集中所有患者的临床病程之间无显著差异。通过将logistic回归模型拟合到训练集，可以将移植后第91~180天期间的“高风险”综合免疫标记简化为评分函数：综合免疫风险评分（移植后第91~180天期间）=白细胞计数（109/L）×0.7304 +中性粒细胞计数（(109/L）×（-0.4745） +淋巴细胞有核细胞百分比（×100%）×（-16.7825） +淋巴细胞计数（109/L）×（-1.7612）+淋巴细胞NK细胞百分比（×100%）×（-7.9450）+淋巴细胞T细胞百分比（×100%）×10.2955 +淋巴细胞CD4+ T细胞百分比（×100%）×（-7.9703） +淋巴细胞B细胞百分比（×100%）×（-15.7887）。当第91~180天复合免疫风险评分> 2.50时，患者被视为“高风险”。
根据第91~180天的综合免疫风险评分，514例训练集患者中的79例（15.4%）和284例验证集患者中的38例（13.4%）为“高风险”。第91~180天期间的“高风险”风险比（HR）为2.69（n=514；95%CI，1.86-3.87；P<0.0001）和3.64（n=284；95%CI，1.55-8.51；P=0.0014）分别用于训练集和验证集中的早期死亡率（图3C）。
然后，研究人员在FAHUSTC的持久性测试集中测试了综合免疫风险评分。FAHUSTC的624例检测集患者中有391例（62.7%）在第91~180天具有可用的移植后免疫特征数据。在第91~180天具有免疫分析数据的测试集患者子集的临床病程与测试集中所有患者的临床病程之间无显著差异。
使用综合免疫风险评分，研究人员根据31~180天的免疫特征将试验组中的391例患者分层为“高风险”（评分> 2.50）和“低风险”（评分≤2.50）；391例患者中的22例（5.6%）在91~180天为“高风险”。可以发现，“高风险”患者确实比“低风险”患者更容易发生早期死亡（HR，2.44；95%CI， 1.22~4.87；P=0.0087；图3C）。因此，尽管在主要由非UCB移植组成的IHCAMS患者队列中应用了综合免疫风险评分的公式，但在UCB为主的FAHUSTC队列中，高综合免疫风险评分也被证明可预测早期死亡率。
总之，在整个SKIRT数据集中，当比较“高风险”患者与“低风险”患者时，复发相关死亡、NRM和感染相关死亡的HR（通过Fine-Gray模型计算，以校正竞争风险）为1.45（95%CI，0.86~2.45；P=0.17）、3.28（95%CI，2.28~4.73；P<0.0001）和3.12（95%CI，1.97~4.96；P<0.0001）（图3D）；即“高风险”患者患NRM的可能性明显高于“低风险”患者。
图3.在第91~180天发现并验证复合免疫风险评分预测早期死亡率
即使将其他因素，如第91~180天期间的平均CD4+ T细胞计数作为协变量纳入Cox回归模型中，第91~180天的高综合免疫风险评分仍然是allo-HSCT后早期死亡的独立风险因素（HR，1.80；95%CI,1.28~2.55；P=0.00085）（图4A）。
在第91~180天，即使将多变量分析限制在所有成人患者的子集，高复合免疫风险评分仍然是死亡率的独立预测因素（HR，1.86；95%CI，1.30~2.66；P=00.00062），包括急性白血病成人患者（HR，1.63；95%CI，1.07-2.50；P=0.024），或患有急性白血病以外疾病的成人患者（HR，2.78；95%CI，1.38~5.60；P=0.0042）。相反，在儿童患者中，第91~180天的平均CD4+ T细胞计数（而不是复合免疫风险评分）是死亡率的独立预测因素（每增加109个细胞/L的HR，0.07；95%CI，0.01-0.70；P=0.024）。
移植后最初90天内的重度aGVHD[比值比（OR），3.23；95%CI，1.87~5.58；P<0.0001]，最初90天内的感染事件数（每次额外发作的OR，1.52；95%CI，1.12~2.06；P=0.0075）和患者年龄（每增加一年OR，1.02；95%CI，1.01~1.04；P=0.0034）都是allo-HSCT后第91~180天出现高综合免疫风险评分的风险因素（图4B）。
图4.第91~180天的综合免疫风险评分可独立预测早期死亡率
研究讨论
本研究是迄今为止最大的HSCT后免疫重建队列研究。与既往许多研究的目的相似，本研究旨在描述免疫重建与临床结局之间的关系。
尽管脐血干细胞移植和外周血干细胞移植之间存在许多差异，在IHCAMS队列（主要由外周血来源的移植组成）和FAHUSTC队列（主要由脐血来源的移植组成）中，综合免疫风险评分是allo-HSCT总生存期的独立预后因素。该研究团队还开发了可公开访问的网络工具— SKIRT计算器（https://skirt-calculator.shinyapps.io/skirt-calculator），以帮助临床医生评估患者移植后免疫重塑进展。
近年来，人们对设计新的计算方法来分析疾病中的多维表型越来越有兴趣（例如，急性呼吸窘迫综合征、Ⅱ型糖尿病、aGVHD和败血症）。对于移植后免疫重建，Toor等人已经开发了使用逻辑动力学将移植后总淋巴细胞计数的时间曲线分为三种不同生长模式的方法，Koenig等人已探索应用主成分分析测量HSCT患者免疫状态与非血液患者免疫状态之间的距离，并使用该距离预测总生存期，以及Mellgren等人已经提出使用反射判别分析将移植后免疫重建分解为两个独立的轴（一个用于细胞正常化，另一个用于功能成熟）。需要注意的是，这些研究均未分析超过50例的HSCT，并对所提出的方法学进行独立验证，或将他们的结果总结成一个易于在临床上应用的评分公式。相比之下，在寻找一个与“体质指数BMI”一样简单的计算方法时，本研究通过整合八个关键免疫学指标，提出了易于临床使用的综合免疫风险评分来预测患者造血干细胞移植后的生存情况。
长期以来，人们已经知道HSCT后的免疫重建概括了发育过程中免疫个体发育的各个方面。然而，还没有“生长图”可以用来定量评估移植后患者的免疫重建。在这项研究中，使用机器学习来可视化个体患者的免疫重建轨迹，发现群体方差在移植后第60天左右最大。
虽然大多数患者的免疫重建在第60天后在相空间中继续向上进化，但在一些患者中，轨迹变得“脱轨”，并向右甚至向下进展，进入“高风险”区域，其特征是在第91~180天期间具有较高的综合免疫风险评分。显然，在随后的1至4个月内，第60天的关键时间点对免疫重建方向起决定性作用。
本研究数据还表明，感染和免疫重建之间存在错综复杂的关系。感染是第91~180天期间进入“高风险”免疫区域的危险因素，而高综合免疫风险评分反过来又是预测感染相关死亡的独立危险因素，即独立于早期感染事件。对于在第91~180天综合免疫风险评分较高的患者，研究者认为需要特别注意预防和控制感染，例如通过在门诊强化监测患者的生命体征和全血细胞计数；或者，可以在这些高风险患者中测试药物或细胞治疗干预，以纠正他们的免疫重建。除了管理这些免疫状态在第91~180天“脱轨”的高风险患者外，还研究了一些潜在干预策略，以了解它们调节HSCT后免疫重建的能力，其中一些策略可能有助于改善“高风险”患者的总体生存率。
由于缺乏正常儿童的数据，本研究没有调查儿童发育与免疫重建之间的关系。然而，参考患者的年龄和免疫系统的正常发育来评估患者的免疫数据是至关重要的。本研究显示，儿童与成人患者的“高风险”免疫标记可能不同。在亚组分析中，发现对于成人患者，第91~180天的综合免疫风险评分比是第91~180天的CD4+ T细胞计数更好的总生存期预后因素，而对于儿童患者来说则相反。
未来的研究方向可能包括在allo-HSCT成人患者中前瞻性验证综合免疫风险评分，研究儿童发育与移植后免疫重建之间的关系，以及阐明移植后第60~180天免疫重建个体间差异背后的分子和细胞机制。
[1]周娅，窦颖；重庆医科大学附属儿童医院血液肿瘤科；国际儿科学杂志, 2022,49(5) : 320-324.
[2]Yigeng Cao, Xiaowen Gong, Yahui Feng, et al; The Composite Immune Risk Score predicts overall survival after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: A retrospective analysis of 1838 cases; Am J Hematol. 2022;1–13.DOI: 10.1002/ajh.26792.
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