CD19是一种特异性表达于B淋巴细胞各个分化阶段的细胞表面抗原，绝大多数B系来源的恶性肿瘤包括B细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）、慢性淋巴细胞白血病（CLL）和非霍奇金淋巴瘤（NHL）细胞均表达CD19。
CD22是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素（Siglecs）家族的一个成员，同时也是B细胞表面抑制性辅助受体之一，它与B细胞的发展、分化和功能密切相关。CD22限制性地表达于成熟B细胞和大多数恶性B淋巴瘤细胞表面，使其成为了自身免疫疾病和B细胞恶性肿瘤治疗的热门靶点之一。
近期，上海交通大学,四川大学，香港大学及圣裘德儿童研究医院等多单位合作（上海交通大学为第一单位），裴正康（Ching-Hon Pui）院士作为通讯作者在Journal of Clinical Oncology在线发表题为“Coadministration of CD19- and CD22-Directed Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy in Childhood B-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia: A Single-Arm, Multicenter, Phase II Trial3”的研究论文，探讨了CD19-和CD22-嵌合抗原受体(CAR) T细胞联合应用于复发/难治性（R/R）B-ALL儿童患者的安全性和有效性。
研究背景
自体CD19导向CAR-T细胞疗法的出现彻底改变了复发或难治性（R/R）急性淋巴细胞白血病(ALL)儿童患者的治疗格局。注册数据显示，tisagenlecleucel（tisa-cel）在85.5%的患者中诱导了完全缓解，在R/R B-ALL的儿童患者中12个月无事件生存期(EFS)为52.4%。然而，仍有约50%的患者在1年内复发，原因包括剪接变异体、获得性基因突变或谱系转换导致的CAR-T细胞持续丢失或CD19抗原丢失。
尽管CD22 CAR-T细胞治疗能诱导70%~80%的CD19 CAR-T细胞治疗失败的患者获得完全缓解（CR），但大多数患者仍会再次复发。基于此，有研究者开发了CD19/CD22双靶点CAR-T细胞治疗来克服抗原逃逸复发。
最近的3项研究显示了CD19/CD22双靶点CAR-T细胞治疗的安全性和可行性，但疗效结果并不优于CD19 CAR-T细胞治疗。其他3项研究探索了CD19 CAR-T细胞和CD22 CAR-T细胞的联合应用，得到的完全缓解率分别为96%、100%和85%，1年无白血病生存率分别为52.9%、79.5%和67.5%。尽管这种疗法与抗原逃逸复发率低相关，但有限的CAR-T细胞持久性引起了人们对快速发生抗原阳性复发的担忧。
临床前研究表明，在肿瘤细胞系模型的一个亚群中，CD19 CAR-T细胞可以下调CD22的表达。因此，基于联合治疗防止ALL耐药性发展的基本治疗原则，假设CD19 CAR-T和CD22 CAR-T细胞的联合应用将提高疗效。而且，临床前模型显示同时靶向可能降低抗原丢失的风险。此外，联合应用可避免反复进行CD19 CAR-T细胞治疗的淋巴细胞清除性化疗。
研究方法
本研究是一项开放标签、Ⅱ期、多中心临床试验。主要研究终点包括CD19 CAR-T和CD22 CAR-T细胞联合应用的推荐Ⅱ期剂量、CAR-T细胞输注相关不良反应、输注后第28天的完全缓解率以及12个月时有或无巩固移植的EFS和总生存期(OS)。
在2019年9月17日至2021年12月31日期间共入组了232例患者，其中225例可评估，包括194例难治性疾病或血液学复发和31例孤立性髓外复发患者。接受难治性疾病或血液学复发治疗的患者入组时的中位年龄为7.6岁（0.8~19.6岁）。从入组至输注的中位时间为7天（6~12天）。
研究结果
主要结局
194例患者中192例获得CR(99.0%)；1例患者在推荐剂量治疗后死于神经毒性，另1例死于细胞因子释放综合征（CRS）。所有192例患者的MRD状态均为阴性。输注后中位随访时间为11.0个月（IQR，6.2~18.0个月；范围，0.1~32.4个月），43例患者复发（24例 CD19+/CD22+复发，16例 CD19-/CD22+复发，1例CD19-/CD22-复发，2例未知），累积风险为22.2%。78例患者进行巩固性移植后，12个月EFS为69.2%（未进行移植的患者的12个月EFS为73.5%）（图1A），12个月OS为87.7%（图1B）。
37例KMT2A重排或ZNF384重排ALL患者中分别有24例和54例因父母要求行巩固移植。接受或未接受巩固性移植的患者的临床和生物学特征无显著差异，除了在输注后≥6个月接受移植的患者均无B细胞再生障碍性贫血（P<0.001，表1）。接受移植的患者12个月EFS优于未接受移植的患者（P=0.03）：85.0% vs 69.2%（图1C）。接受或未接受移植的患者12个月OS差异无统计学意义（P=0.40）：91.3% vs 85.0%（图1D）。对于许多类别的患者，移植与更好的EFS相关（表1）。
图1
表1. 194例难治性白血病或血液学复发患者的临床和生物学特征及78例巩固造血细胞移植患者与116例未接受巩固造血细胞移植患者的EFS比较
次要结局
截至输注后第28天，分析所有181例患者的外周血或骨髓，发现均发生了B细胞再生障碍性贫血。血液和/或骨髓中至B细胞正常恢复(≥1%)的中位时间为74.0天（IQR，47.8~97.8天；范围，27~371天）。输注后6个月，B细胞再生障碍贫血的累积发生率为59.8%（95%CI，50.4~69.2；图1E）。输注后≥2个月持续性B细胞再生障碍性贫血患者的EFS逐渐改善：2、3、4和6个月时分别为77.0%、88.7%、97.4%和100%（图1F）。
在接受CD19 CAR-T细胞和CD22 CAR-T细胞联合给药而未接受巩固性移植的116例患者中，CAR-T细胞治疗前的MRD为15%（70.7% vs 54.6%，P=0.04）、M1骨髓状态（76.3% vs 58.3%，P=0.05）、持续B细胞再生障碍性贫血≥6个月，与良好的12个月EFS显著相关（100%vs 47.2%，P<0.001）。
在多变量分析中，与更好的EFS相关的因素包括接受巩固性移植（HR，0.24，P=0.07）和输注后B细胞再生障碍性贫血持续≥6个月（100%无事件；HR，1.88×109（P<0.001；表2）。
表2. 194例接受CD19/CD22 CAR-T细胞治疗患者中与EFS和OS相关因素的单变量和多变量分析
CAR-T细胞持久性
通过使用定量聚合酶链反应检测CAR转基因，发现在76例患者中，CD19 CAR-T细胞比CD22 CAR-T细胞更早发生扩增（7.3±0.5天vs 10.9±0.9天，P=0.0013）。CD19 CAR-T细胞比 CD22 CAR-T细胞在更长的时间内具有更强的扩增能力（图2）。在检测的21例复发患者中，所有11例 CD19+/CD22+复发患者在复发时均丧失了CD19 和 CD22 CAR-T细胞持久性。在检测的9例CD19-/CD22+复发患者中，在复发时CD22 CAR-T细胞持久性均丧失，而4例患者仅丧失了CD19 CAR-T细胞持久性。CD19–/CD22–复发的患者在复发时仅保留了CD19 CAR-T细胞持久性。
图2. 血液中(A)CD19、(B)CD22和(C)CD19和CD22 CAR-T细胞的扩增和持续性
孤立性髓外复发
31例患者因孤立性髓外复发接受治疗(数据补充)。他们的中位年龄为7.6岁（IQR，6.0~10.3；范围，1.4~15.5岁），从入组到输注的中位时间为7天（6~11天），CD19和CD22 CAR-T细胞联合给药的中位剂量为7.0×106/kg（IQR，5.3~8.9×106；范围，1.4~14.0×106）。CD19 CAR-T细胞的中位剂量为3.0×106/kg(IQR，2.2~4.1×106)，CD22 CAR-T细胞的中位剂量为3.4×106/kg(IQR，2.7~4.8×106)。CD19 CAR-T细胞剂量与CD22 CAR-T细胞剂量的中位比值为0.87(IQR，0.77~1.01)。16例患者有一个或多个高危因素，包括第二次或第三次复发、既往接受过同种异体移植或CD19 CAR-T细胞治疗、治疗期间复发或伴有不良基因型。所有患者在没有局部放疗的情况下获得了CR。
不良事件
198例(88.0%)患者发生CRS，64例(28.4%)患者为≥3级，1例患者为致死性。47例(20.9%)患者发生神经毒性，9例(4.0%)患者为≥3级，2例分别接受12.0×106和5.6×106个CAR-T细胞/kg的患者出现致死性神经毒性。14.2%的患者发生了3级或4级癫痫发作，与其他患者相比，这些患者更常出现孤立性或合并CNS白血病（42例患者中的10例与183例患者中的22例）。40.9%的患者发生3级或4级低血压。167例(74.2%)患者接受了托珠单抗治疗，79例(35.1%)患者接受了皮质类固醇治疗。3~4级CRS患者中白细胞介素-6和γ-干扰素的峰值水平显著高于0~2级患者（P<0.001；数据补充）。
表3. 194例难治性白血病或血液学复发患者和31例孤立性髓外疾病患者接受治疗后的安全性结局
研究讨论
在这项迄今为止最大的（据研究者所知）针对儿童ALL患者接受CAR-T细胞治疗的前瞻性研究中，CD19 CAR-T和CD22 CAR-T细胞治疗的联合应用，在99.0%的患者中诱导了MRD阴性的CR。有或没有进行巩固移植的患者，他们的12个月EFS分别为69.2%和73.5%，12个月OS为87.7%。似乎比tisa-cel的真实世界临床结局更好。这可能是因为同时给予患者两种不同的CAR-T细胞，促进了他们白血病克隆的早期根除，从而阻碍了耐药性的发展。
与两项大型CD19 CAR-T细胞治疗研究相比，本研究产生了更高的完全缓解率（分别为99% vs 88%和93.5%）和更低的复发率（分别为22.2% vs 36%和31.5%），表明通过CD22 CAR-T细胞产生了额外的免疫作用。
此外，本研究中CAR-T细胞的快速制备能够让患者在约1周的时间内就输注到新鲜的CAR-T细胞，这也可能有助于改善治疗结局。与冻存的CAR-T细胞相比，新鲜的CAR-T细胞功能可能更强、更有效。
而本研究中CRS的中位发生时间仅为1天，至患者首次接受托珠单抗治的中位时间为2天，表明本研究的CAR-T细胞能够快速而稳健地增殖。
此外，在不进行白细胞分离的情况下，在7天内快速产生CAR-T细胞也使研究者能够根据患者的临床状况和总的B细胞和原始细胞计数来优化输注时间，减少了在等待期间发生疾病进展的患者进行桥接化疗的需求。
在输注CAR-T细胞之前，疾病负担过低或过高都与疾病复发有关。在疾病负担低的患者中，由于缺乏抗原刺激而导致的CAR-T细胞持久性降低与B细胞再生障碍性贫血的早期丧失和CD19-白血病复发相关。高疾病负担与CD19-复发相关，这一发现可归因于白血病增殖期间产生耐药性或预先存在的少数通过标准流式细胞术检测不到，但在CD19-清除后出现的CD19-疾病。在这方面，本研究中的MRD≥15%的患者的EFS比MRD<15%的患者差。
CD22 CAR-T细胞缺乏扩增和持续性可以通过白血病母细胞上CD22相对于CD19抗原表达较低或CD22scFV信号活性差来解释。对CD19更频繁丢失的其他解释可能包括在CAR-T细胞治疗前，既存CD19-白血病细胞比CD22-白血病细胞更活跃，或者获得性突变和选择性剪接在CD19中更常见。因此需要进一步研究确定增强CD22 CAR-T细胞的持久性和活性是否会改善结果，如增加CD22与CD19 CAR-T细胞的剂量比、重复输注CD22 CAR-T细胞以及使用替代启动子scFV信号域或初始T细胞。
迄今为止，还没有可靠的标志物来预测CAR-T细胞治疗后的复发。因此，一些研究者建议使用CAR-T细胞疗法作为所有患者巩固移植的桥梁。巩固性移植在一项CD19 CAR-T细胞治疗试验中提供了长期持久的疾病控制，但在另一项连续的CD19和CD22 CAR-T细胞研究中没有改善存活率。在本研究中，巩固移植与更好的EFS相关，这一结果尚未转化为更好的OS，因为一些未接受移植的患者是可挽救的，而另一些患者仍然带病生存。在本研究中，≥6个月的持续性B细胞再生障碍性贫血也是一个独立的有利预后因素，与12个月EFS为100%相关，表明具有该特征的患者不需要移植。
然而，在最近的一项关于tisa-cel的研究中，检测B细胞再生障碍性贫血并不像通过下一代测序的MRD检测那样能预测复发，而且CD19-复发可能在B细胞再生障碍性贫血持续存在的患者中早期发生且频率较高。因此需要进行额外的研究来确定检测B细胞再生障碍性贫血作为一种补充检测的临床实用性。
受CD19 CAR-T细胞清除复发CD19-B-ALL患者脑脊液中白血病细胞的能力的鼓舞，几项研究探索了这种方法在治疗孤立性髓外复发中的作用。在一项睾丸复发白血病的研究中，7例患者中有6例在缓解期存活了5~23个月。在一项CNS复发白血病的研究中，5例患者中的4例在缓解状态下存活了15~29个月。在对5项研究中44例CNS复发患者的汇总数据分析中，2年无复发生存率为66%。在最近的另一项多中心研究中，22例孤立性CNS复发患者的12个月无复发生存率为66.1%，13例CNS和血液学联合复发患者的12个月无复发生存率为49.5%。在本研究中，所有31例孤立性睾丸或CNS复发患者均获得完全缓解。孤立性睾丸和 CNS复发患者的12个月EFS分别为95.0%和68.6%。值得注意的是，接受血液病和髓外复发联合治疗的48例患者中，仅1例患者后续发生了髓外复发。这些初步结果令人鼓舞，CAR-T细胞治疗可能成为髓外复发患者的一种治疗选择。
本研究中出现了相对较高频率的CAR-T细胞相关的3级或4级低血压发作(41.3%)和癫痫发作(14.2%)，研究者将其归因于快速和强大的CAR-T细胞扩增。在目前实施抗惊厥预防的孤立或混合性中枢神经系统白血病患者中，癫痫发作率尤其高（23.8%，其他患者为12.0%）。
本研究也存在着一定的局限性。例如。本研究无法使用历史对照研究数据来比较长期结局，因为在本试验中有很大比例的患者接受了巩固性移植。另一个局限性是未进行MRD检测。此外，还需要更长时间的随访来确定本研究中的患者是否会发生晚期CD19-复发，如在接受tisa-cel治疗的患者中观察到的那样。
Tianyi Wang, Yanjing Tang Jiaoyang Cai, et al; Coadministration of CD19- and CD22-Directed Chimeric Antigen Receptor T-Cell Therapy in Childhood B-Cell Acute Lymphoblastic Leukemia: A Single-Arm, Multicenter, Phase II Trial; Journal of Clinical Oncology; DOI https://doi. org/10.1200/JCO.22. 01214.
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