在撒哈拉以南的非洲，伯基特淋巴瘤（BL）是最常见的儿童癌症，其中Epstein-Barr病毒(EBV)是引起地方性BL的主要原因。伯基特淋巴瘤是增长最快的人类肿瘤，快速增殖的癌细胞对铁的需求增加，然而，目前对其铁代谢知之甚少。对此，Blood期刊近期发表了一项研究了通过CRISPR/Cas9人类全基因组筛选评估了铁还原酶在B细胞生长和存活中的作用。
研究背景
在B细胞感染时，EBV使用潜伏程序将B细胞转化为淋巴母细胞。由6个EBV核抗原(EBNAs)和2个膜蛋白组成的EBV潜伏Ⅲ程序，驱动感染细胞进入生发中心。如果不通过免疫监视进行检查，潜伏期III将B细胞转化为永生化淋巴母细胞样细胞系(LCL)。在具有免疫活性的宿主中，EBV感染的细胞反而分化为记忆B细胞，其中病毒潜伏I程序只表达单个EBV编码的蛋白。在大多数EBV1 伯基特淋巴瘤中观察到潜伏期I。
转铁蛋白结合的铁通过转铁蛋白受体(TFRC)介导的内吞作用递送至细胞。溶酶体酸化是铁(Fe31)从转铁蛋白释放和还原为Fe21进行胞质转运所必需的。TFRC对淋巴细胞发育至关重要，同时亚形TFRC突变引起严重的B细胞和T细胞免疫缺陷。STEAP蛋白催化铁还原为亚铁，通过DMT1进行胞质转运，使用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)作为电子供体。细胞色素561(CYB561)完整的膜蛋白，利用抗坏血酸作为跨膜转运的电子供体，也能还原三价铁。CYB561A3，也称为溶酶体Cyt561或LCytb，在巨噬细胞的晚期内体/溶酶体膜中表达。CYB561A3似乎在高度特异性的细胞生态位中发挥作用。CYB561A3在酵母中表达时表现出铁还原酶活性。本文研究分析了CYB561A3对EBV1 伯基特生长和存活中的作用。
研究结果
CYB561A3对伯基特增殖至关重要
在多重假设检验校正q（0.05临界值）后，在伯基特与LCL增殖选择性重要的57个人类基因中，CYB561A3是最高命中。所有4种靶向CYB561A3的sgRNA在P3HR-1中高度耗尽，但在GM12878中未耗尽，表明CYB561A3在P3HR-1增殖中具有选择性重要作用。CYB561A3的得分要强于一些已明确的致癌伯基特驱动因子，包括BCL6、细胞周期蛋白依赖性激酶和细胞周期蛋白D3。癌症依赖性图谱(DepMap)CRISPR分析进一步强调了CYB561A3仅是712个癌细胞系中3种伯基特细胞系（Raji,Blue1,和BL70）。在另外几种生发中心来源的B细胞淋巴瘤中也观察到一些CYB561A3 CRISPR信号。DepMap CRISPR筛选图谱与CYB51A3最接近的基因是B细胞分化中重要的转录因子：PAX5、MEF2B、EBF1和POU2AF1/Oca-B（图1）。
研究检测了来源于地方性伯基特肿瘤样本的等基因对细胞系，其差异仅在于EBV潜伏I与III程序（Mutu I与III）。CYB561A3 sgRNA抑制Mutu I，但不抑制Mutu III增殖，表明病毒潜伏III程序挽救了CYB561A3依赖性。同样，CYB561A3抑制Kem I潜伏期I地方性伯基特淋巴瘤细胞的增殖，但不抑制从相同肿瘤样本建立的Kem III潜伏期III LCL的增殖。利用RNA测序数据，研究者发现EBV在B细胞感染后48小时下调CYB561A3信使RNA水平（图1）。伯基特 CYB561A3依赖不需要潜伏期I，因为治愈EBV的Akata 伯基特细胞作为再感染的EBV1克隆对CYB661A3耗竭保持相似的敏感性，3个DepMap 伯基特细胞系中的2个为EBV–（BL70和Blue1）。CYB561A3敲除（KO）可降低具有中度DepMap CRISPR信号的3种EBV–B细胞系的增殖：前体B细胞ALL REH、弥漫性大B细胞淋巴瘤SU-DHL4和多发性骨髓瘤RPMI 8226细胞（图1）。
图1 对P3HR-1 伯基特与GM12878 LCL选择性重要的选定最高匹配结果的统计学显著性； sgRNA log2倍数变化值在第21天的分布与Cas91 P3HR-1 伯基特淋巴瘤（左）或GM12878 LCL（右）输入的比较；CYB561A3和CYB561靶向sgRNA的值
为研究CYB561A3 KO对伯基特细胞周期的影响，进行了碘化丙啶分析。在sgRNA表达后第9天，CYB561A3耗竭首次显著降低增殖的时间点，G2/M中P3HR-1细胞的比例增加，表明细胞周期停滞。CYB561A3耗竭未显著改变GM12878细胞周期。Mitosox FACS分析也表明，CYB561A3耗竭增加了线粒体活性氧。在CYB561A3缺失的P3HR-1中，溶酶体标记物Lysotracker Red的活细胞染色稳健，进一步表明CYB561参与伯基特细胞溶酶体生理学。铁缺乏可触发线粒体自噬，其中线粒体被递送至溶酶体，用于从线粒体储存库清除铁，包括对呼吸链重要的Fe-S簇。结果表明，伯基特细胞需要CYB561A3进行溶酶体和线粒体稳态（图2）
图2 CYB561A3 KO导致伯基特细胞周期阻滞以及溶酶体和线粒体损伤。
CYB561A3 KO下调金属离子反应基因并导致铁缺乏。CYB561A3缺失显著下调的多个基因被EBV潜伏期III上调，包括HSP70成员和金属硫蛋白MT1A和MT2A，（主要作用是富含半胱氨酸的蛋白质，隔离金属离子，可以保护细胞免受铁诱导的氧化应激)。ECYB561A3 sgRNA增加了P3HR-1和Mutu I中的IRP2水平，但在GM12878或GM11830 LCL中没有。CYB561A3 KO降低了铁蛋白重链和轻链（分别为FTH1和FTL）的水平，其蛋白表达受IRP1/2.49负调控。CYB561A3 KO也增加了P3HR-1 TFRC水平，与细胞对铁减少的反应一致。CYB561A3R cDNA可阻止内源性CYB561A3 KO引起的这些变化。CYB561A3耗竭也降低了REH、SU-DHL4和RPMI 8226中的铁蛋白重链水平，表明在具有一些CYB561A3依赖性的这些DepMap B细胞中发挥铁代谢作用。补充30 mm柠檬酸亚铁可恢复CYB561A3 KO P3HR-1中的野生型(WT)增殖水平。CYB561A3缺失也可保护细胞免受添加60 mm枸橼酸亚铁诱导的铁毒性（图3）。抗坏血酸盐和CYB561A3电子穿梭在伯基特细胞铁获取中的作用此外，编码细胞色素b561家族成员CYB561的cDNA在儿茶酚胺合成中具有非溶酶体铁还原酶作用）无法挽救CYB561A3耗竭（图4）。这些结果表明，溶酶体CYB561A3铁还原酶活性是其伯基特细胞依赖因子作用的基础，可能是抗坏血酸电子供体。
图3 CYB561A3的缺失将引起P3HR-1铁饥饿反应。
图4 CYB561A3铁还原酶活性对伯基特 B细胞铁获取
CYB561A3 KO消耗细胞和线粒体亚铁池
鉴于线粒体含有大量的细胞铁储备，包括Fe-S簇，研究使用活细胞成像来评估CYB561A3 KO对线粒体Fe21丰度的影响。CYB561A3 sgRNA显著增加P3HR-1而非GM12878中的RPA信号（图5），表明线粒体Fe21水平降低。CYB561A3 KO导致OXPHOS复合物I（包含8个Fe-S簇）的稳态水平轻度降低（。CYB561A3缺失也降低了脂化丙酮酸脱氢酶(PDH)和A-酮戊二酸脱氢酶(KGDH)的水平（图5）。补充柠檬酸铁可部分恢复这些缺陷。总的来说，这些结果表明CYB561A3对伯基特细胞线粒体Fe-S生理CYB561A3在浆细胞样树突状细胞和B细胞的造血细胞中表达量最高（图6）。因此，STEAP3表达升高可能是缓解细胞对CYB561A3依赖性的重要因素。另外，目前确定的因子也可能（或相反）有助于细胞是否依赖于CYB561A3的表达来存活。
图5 CYB561A3 KO对 伯基特细胞亚铁的影响。
图6 铁还原酶STEAP3对LCL和伯基特细胞的影响。
研究结论
总体而言，CRISPR/Cas9分析铁还原酶CYB561A3对伯基特细胞增殖起关键作用，但对密切相关的EBV转化的淋巴母细胞样细胞或几乎所有其他癌症依赖图细胞系不是关键的。CYB561A3敲除诱导了明显的铁饥饿，尽管铁蛋白自噬和质膜转铁蛋白上调。抗坏血酸（一种关键的CYB561家族电子供体）或不稳定的铁源柠檬酸亚铁浓度升高可挽救 CYB561A3缺乏症。CYB561A3敲除引起灾难性溶酶体和线粒体损伤，线粒体呼吸受损。相反，具有转化EBV潜伏III程序的淋巴母细胞样B细胞反而依赖于STEAP3铁还原酶。这一结果也提示了CYB561A3将是治疗性伯基特淋巴瘤靶点之一
Wang Z, Guo R, Trudeau SJ, et al. CYB561A3 is the key lysosomal iron reductase required for Burkitt B-cell growth and survival. Blood. 2021;138(22):2216-2230. doi:10.1182/blood.2021011079
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