以基因为导向的个性化靶向治疗是非小细胞肺癌（NSCLC）领域的诊疗热点。近年来，针对RET基因融合的靶向药物相继获批上市用于NSCLC治疗，使得RET基因融合检测成为国内外研究重点关注的方向。近期，上海交通大学附属胸科医院韩昱晨教授团队的一项研究“通过DNA测序和RNA测序鉴定和验证NSCLC中非经典RET融合”的成果亮相2021年欧洲肿瘤内科学会（ESMO）国际舞台。这项研究开展的初衷是什么？研究取得了哪些重要结果？该研究结果会对临床带来什么样的改变和意义？【肿瘤资讯】特邀上海交通大学附属胸科医院韩昱晨教授和向婵博士就以上问题进行深度分享。
上海交通大学附属胸科医院 病理科主任
国际肺癌研究组织（IASLC）病理委员会委员
中华医学会病理学分会胸部学组副组长
中华医学会病理学分会分子病理学组委员
上海市医学会分子诊断专科分会委员
上海市医学会病理分会委员
上海市医师学会病理委员会委员
中华病理学杂志通讯编委
上海交通大学附属胸科医院 病理科
“罕见”但重要，RET融合检测助力实现NSCLC精准诊疗
韩昱晨教授：在本研究中，我们选择RET基因作为研究对象主要基于两个方面的原因：
首先，RET融合这个靶点非常重要。肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率位居我国恶性肿瘤前列。近十余年来，靶向治疗药物极大地延长了驱动基因阳性晚期NSCLC的生存期，也使这些患者的生活质量得到了明显提高。随着基因检测技术，尤其是二代测序（NGS）技术的发展与临床应用，除常见驱动基因变异（如EGFR、ALK等基因变异）以外，越来越多的罕见基因变异（如RET融合、MET扩增或exon 14跳跃、ROS1融合等）也被检测到并在临床得到应用。
“罕见”是指这一类基因变异的发生率较低，但这并不代表携带这些基因变异的患者的绝对数量少。我国NSCLC患者中RET融合的发生率约为1.4%~2.5%，但以我国每年的NSCLC新发病例数来估算，中国每年新发RET融合阳性NSCLC患者可以达到上万人。而这些数以万计的RET融合阳性的NSCLC患者可以从针对RET融合的靶向治疗中获益。
第二，目前临床上针对RET融合检测方法的选择非常重要。随着药物研发的进步，针对罕见基因变异的靶向药物层出不穷，并展现出显著的临床疗效。2021年3月24日，普拉替尼正式获得中国国家药品监督管理局（NMPA）批准，用于既往接受过含铂化疗的RET基因融合阳性局部晚期或转移性NSCLC成人患者，成为首个在中国获批的RET抑制剂。另一款RET抑制剂Selpercatinib已在美国获得FDA批准，但尚未在国内上市。这些RET抑制剂的出现，为更多RET融合阳性的NSCLC患者带来获益，也使得规范检出携带有RET融合的NSCLC成为目前临床的当务之急。
基于这些背景，2021版《CSCO非小细胞肺癌诊疗指南》对RET融合检测做了更新，对于不可手术的III期及IV期NSCLC患者，RET融合检测上升至与EGFR、ALK、ROS1基因检测并行的I级推荐检测。这意味着NSCLC患者可能需要更广泛地进行RET融合检测，以筛选出可能从RET抑制剂治疗中获益的RET融合阳性患者，为这类患者提供最大化的治疗获益。
此外，RET融合也是EGFR-TKI及ALK-TKI获得性耐药机制之一。因此，RET融合的检测对于EGFR-TKI及ALK-TKI耐药患者的预后及耐药后治疗也有指导意义。对于接受过EGFR-TKI或ALK-TKI并耐药的患者，推荐其进行RET融合检测，检测阳性的患者可以接受RET抑制剂治疗。
多种检测手段应用于RET融合检测，新的非经典RET重排不断被发现
向婵博士：对于融合基因检测，目前常见的检测方法包括免疫组织化学（IHC）、荧光原位杂交（FISH）、实时荧光聚合酶链式反应（RT-PCR）、基于NGS平台的DNA测序（DNA-seq）和RNA测序（RNA-seq）等，不同的方法都有各自的优缺点。
IHC在临床病理诊断中广泛应用。研究表明IHC检测RET融合的灵敏度为50%~100%，特异度为30%~90%。在IHC的实际操作过程中，存在抗体选择多样、参照标准不明确等问题。因此，目前IHC未被ESMO推荐作为RET融合检测的常用手段。
FISH是检测基因易位/融合的“金标准”。其优点在于对肿瘤细胞的含量要求较低（样本中存在50个以上的肿瘤细胞即可进行判读），但是在检测RET融合时也存在以下几个弱点：首先，FISH检测不能提供关于融合伴侣的充分信息；其次，FISH检测对于操作和判读要求相对较高，需要有经验丰富的医师进行结果的判读；再者，FISH只能检测DNA水平的RET基因重排，但对于RNA水平未产生实质性基因融合的病例，FISH可能会出现假阳性的情况。除上述因素外，FISH检测KIF5B-RET、CCDC6-RET等经典RET融合的灵敏度很高，达95%以上，而其他非经典融合如NCOA4-RET灵敏度较低，仅为66.7%。
RT-PCR是我们分子检测最常用的方法之一。RT-PCR法检测RET融合的特点在于快速、简便易行、能同时明确RET已知的融合类型等，但RT-PCR不能检测未知RET融合类型，因此存在假阴性可能。
DNA-seq的NGS在临床上的应用也较广泛。在DNA水平上可以同时检测到包括已知和未知位点在内的所有RET基因易位，但是准确性会受捕获探针的覆盖度、标本DNA质量，以及生物信息学分析等关键因素影响。且DNA水平检测到的融合断裂位点可能并不代表RNA水平的融合位点，在极少数情况下，DNA水平上检测到的基因易位并不会引起融合基因的表达。目前文献报道DNA-seq的灵敏度为87.2%~100%，特异度为98.1%~100%。因此，基于DNA的靶向测序分析通常辅以RNA测序方法验证。
RNA-seq的NGS平台检测RET融合基因，包括基于扩增子的RNA测序和基于靶向捕获的RNA测序。基于扩增子的RNA测序检测范围一般仅局限于特定的常见融合类型，罕见融合可能会漏检。基于靶向捕获的RNA测序其准确性也受到探针覆盖度、生信分析等因素影响。此外，由于RNA很容易降解，RNA-seq对样本质量要求也比较高。
总的来说，随着DNA-seq的广泛应用，越来越多不常见的RET重排被发现。那么这些DNA水平的非经典RET重排的临床意义是怎样的？它们是否能够产生功能性框内融合转录本，从而使得患者可以从RET靶向治疗中获益？基于这些问题，我们进行了相关探索。
DNA-seq与RNA-seq检测相结合探寻NSCLC中非经典RET融合的临床意义
向婵博士：在本研究中，我们回顾性纳入了149例通过DNA-seq检出携带RET重排的NSCLC病例。KIF5B-RET和CCDC6-RET是两种重要的经典RET融合，除KIF5B-RET和CCDC6-RET融合之外的RET融合都被归类为非经典RET融合。因此，本研究中非经典RET重排包括：
1) 重排的伴侣基因不是KIF5B和CCDC6；或
2) 重排的伴侣基因尚未被报道；或
3) 与基因间区域融合的重排，包括基于DNA-seq结果预测的框外RET转录本；或
4) 存在不止一种RET融合的重排。
根据DNA-seq检测结果，我们排除了90例只携带KIF5B-RET或CCDC6-RET融合的病例，进一步排除5例样本量不足的病例后，54例携带有非经典RET重排的病例被纳入后续的RNA-seq检测。
经过RNA-seq数据质控后，最终我们纳入了44例携带非经典RET重排的配对DNA-RNA测序数据进行比较分析。分析显示，44例样本中有41例在RNA水平上检出了RET融合。在进一步分析中，我们根据DNA-seq是否检测到保留RET-3’端的重排（即是否保留其完整激酶活性域），以及通过DNA层面的RET重排预测是否产生阅读框内RET融合，将44例样本分为三组:
● A组：DNA层面RET基因重排保留3’端，且预测能产生阅读框内融合（33例，75%）；
● B组：DNA层面RET基因重排保留3’端，且预测产生移码/框外融合（9例，20.5%）；
● C组：DNA层面仅检测到RET基因5’端重排（2例，4.5%）。
分析发现，A组中96.9%的样本在DNA水平的RET重排也可在RNA水平被检测到，一致性最高；B组中88.9%的样本RNA-seq检测到了功能性RET融合转录本；C组中有一例样本在RNA水平上检测到真实的融合转录本。基于以上分析，我们得到一个初步结论，即在DNA水平上检测到的大部分非经典RET重排都可以在RNA水平上得到验证。
值得一提的是，在本研究中有一例IV期并伴骨转移的患者，既往接受过多线化疗及免疫治疗。在治疗失败之后，通过NGS检测发现该患者同时携带有经典的KIF5B-RET融合及一种非经典RET-FAM107B融合。之后患者接受了RET抑制剂治疗，目前治疗已持续13个月，且仍在治疗中。这一病例说明同时携带经典和非经典RET融合的患者可以从RET抑制剂治疗中获益。可惜的是，本研究中仅有这一例患者接受了RET抑制剂治疗，研究中发现的其他非经典RET融合对于RET抑制剂治疗的有效性还需要临床持续地关注。
不同类型非经典RET重排在DNA/RNA水平表现不一，进一步指导临床RET融合鉴定与验证
韩昱晨教授：这项研究结果对我们的临床实践很有意义。随着DNA-seq被应用于临床实践，有更多RET重排被检测出来。如果DNA-seq检测出携带KIF5B/CCDC6-RET以外的非经典RET重排，则可以根据以下情况选择是否进行RNA水平的验证：
如果DNA-seq检出的RET重排保留RET 3’端，且预测可以产生框内融合，那么在RNA水平检出相同RET融合的可能性非常高，对于这类样本可以不进行RNA水平的验证；
如果DNA-seq检出的RET重排保留RET 3’端且预测产生移码/框外融合，或者DNA-seq只检测出RET 5’端的重排，那么在RNA水平可能具有与DNA水平不同的融合伴侣和融合位点。这类样本建议在RNA水平进一步进行验证，采用的验证手段有RT-PCR或RNA-seq。RNA-seq是最理想的验证方式，但其检测周期长，需要的样本量较多，且对样本的质量要求也高，如果有足够肿瘤组织样本理想情况下进行DNA-seq、RNA-seq配对检测。RT-PCR检测平台较普遍、操作更简便且检测周期相对快，在临床科室中更容易开展。因此，如果不具备RNA-seq的条件，可以选择更经济便捷的RT-PCR法进行验证。
另一方面，本研究中有一例同时携带经典与非经典RET融合的病例对RET抑制剂治疗有效，其对RET抑制剂治疗有反应的作用机制也尚不清晰，还需要我们筛选到更多这种类型病例的临床数据进行相关探索与分析。相信随着RET基因病理样本的积累，未来会有更多、更新的RET基因融合位点被发现，而携带这些RET融合的患者能否从RET靶向治疗中获益，以及会有多大程度的获益，也是非常值得我们去探索研究。
病理医师通过专业、规范化检测实现RET融合精准检测和治疗
韩昱晨教授：基于目前的临床实践，准确检测RET融合是实施RET抑制剂治疗的前提。如何更好地在临床实践中开展RET融合检测，2021版《中国非小细胞肺癌RET基因融合临床检测专家共识》（以下简称《共识》）给出了很多规范化建议。《共识》指出，在进行RET融合检测前，均需要由专业的病理医师对检测所采用的组织样本或者细胞学样本进行肿瘤细胞含量评估，并根据样本类型、肿瘤细胞含量、样本质量合理选择检测方式。因此，病理医师在RET融合检测中起到至关重要的作用。病理医师通过专业、规范化的操作准确评估肿瘤样本，并选择合理的检测方法，这是实现RET基因规范化检测与精准诊断中非常重要的一环。只有这样才能获得可靠的检测结果，为临床开展针对个体的精准化治疗提供有益的帮助，最终帮助患者得到最大限度获益。
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