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AACR 2024回顾 | Alexander Marson教授：利用CRISPR解码和重编程人类T细胞回路

2024年04月30日

编译：肿瘤资讯

来源：AACR 2024

2024年第115届美国癌症研究协会（AACR）年会于2024年4月5-10日在美国圣地亚哥举行，大会汇聚全球肿瘤研究领域的顶尖专家学者，共同探讨肿瘤早期研究与创新进展。恶性肿瘤逐年不断上升的发病率与死亡率严重威胁了人类的健康与生命，有效的抗癌疗法是全球肿瘤专家不断努力的热点。近几年，加利福尼亚大学旧金山分校的Alexander Marson教授团队利用CRISPR基因“剪刀”，成功从各种类型的人类免疫细胞中将目标基因靶向敲除，旨在探索如何设计免疫细胞，以开发出更有效的对抗癌症和其他疾病的治疗方法。

在2024 AACR中，Alexander Marson教授围绕“CRISPR解码和重编程人类T细胞回路”为主题进行了报告分享。【肿瘤资讯】小编对其演讲内容进行了要点整理，以飨读者。

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利用CRISPR可对基因进行深度诱变

众所周知，在过继性细胞疗法中患者的T细胞通常被拾取进行治疗，使用非靶向慢病毒或逆转录病毒将CAR（嵌合性抗原受体）插入T细胞中，利用CRISPR改变单个核苷酸，去除限制某些细胞功能的检查点，甚至在基因组的目标位置引入大块的合成代码，可能会对无法治愈的癌症具有效果。随着分子操作技术的进步，加速开发基因组的合成程序、发现具体目标写入细胞、调整抗原和组织目标的反应强度、调整药物半衰期以及影响肿瘤微环境来消灭癌细胞等方向成为当下研究的热点。为了使T细胞对肿瘤目标具有抗原特异性，必须添加额外的特征来增强它们，使它们能够克服免疫抑制微环境，使它们更持久、更有效，Alexander Marson教授团队在这方面进行了大量的工作。他们开发了一种完全非病毒版本的CRISPR，即绕过任何病毒载体的需要，引入DNA序列（包括一个CAR或TCR）到一个特定基因组位点，每个细胞就会得到不同的合成密码，形成细胞池。Alexander Marson教授团队应用正向遗传学大规模测试基因组中的每个基因，并利用CRISPR技术直接带入初级人类T细胞中学习控制T细胞功能的每个基因的规则，探索它们在细胞系中拥有的特性。随后，通过功能性筛选，具有研究需要特征的免疫细胞被提取出来，用来系统地绘制出每一个基因扰动以及对单细胞转录状态的整体影响。团队成员通过系统筛选发现RASA2是一个细胞内检查点，当T细胞处于免疫抑制环境或长期受到刺激时，它会抑制T细胞的功能。研究数据表明，在血液恶性肿瘤甚至实体肿瘤的临床前模型中用CRISPR去除RASA 2可以改善CAR-T细胞的功能，这为临床提供新的目标来改善免疫疗法。当然，如果以合成生物学角度来看，未来的研究其实不仅仅局限于去除基因，还可以选择在CAR（嵌合性抗原受体）或TCR中添加基因，制造T细胞池以达到增强抗癌功能的目的。

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利用CRISPR有望创建一个庞大的基因组变异等位基因库

正向遗传学理论指明，对于基因的研究，我们得到的不仅仅是控制表型的重要基因列表，还有变异等位基因，但应用以上的CRISPR敲除、GA和CRISPR激活等工具并未展示出这部分内容。于是为了创建一个庞大的基因组变异等位基因库，Alexander Marson教授团队成员利用另一种CRISPR工具（由哈佛大学David Liu开发）引入目标突变进行研究。他们在原代T细胞中大规模应用这种方法，对目标基因进行数百次编辑（选择近400个基因，并在它们之间引入近12万个突变），最终构建了一个巨大的深度突变的人类T细胞池。研究人员依据其特征对这些细胞进行分类，并对其特征及特定状态进行逐一验证和评估；他们把这些遗传信息叠加到正在突变的蛋白质结构信息上，观察对下游读数（细胞因子的产生）的影响并进行图谱绘制，包括干扰素γ、TNF α、PD-1 IL-2受体、CD 25等细胞因子。通过制造出这些高通量突变，将基因与生物化学结合起来，深入了解调节人类T细胞功能的蛋白质特定结构特征。有趣的是，在相同的蛋白质中发现的一些碱基编辑却产生了相反的效果。

VAV是T细胞受体下游的一个信号分子，它在很多研究中已经被充分研究过。通过以上方法研究VAV可以看到：其通过折叠使自己处于非活性确认状态，其中的酸性结构域就像开关一样释放这种自我抑制，当这些酪氨酸被磷酸化时，VAV将进入活性状态。在某些恶性肿瘤中T细胞会释放这种对VAV的自动抑制，那么通过进行这种潜在的结合位点突变，则可以获得对应功能。当然正向和负向的两种不同突变可以在同一个蛋白质中对细胞状态产生相反的影响，这些可以在许多细胞因子中得到印证，如TNF。令人意外的是，体外试验研究表明，研究人员可以调节细胞因子的产生，即在创造出一系列不同突变的定量等位基因的情况下，给予相应的刺激后，可输出预想的可以调节T细胞反应的细胞因子，进而对肿瘤微环境及肿瘤细胞产生影响。

高分辨率碱基编辑展现出新位点

研究人员在筛选将近400个基因过程中发现，将天然化脓性链球菌CAS9与NG PAM结合后，利用这个PAM能够定位这些基因中大约30%的氨基酸；如果可以将PAM的需求放宽到NG，将可以定位60%以上的氨基酸。基于这样的发现，研究人员利用工程化CAS9作为T细胞的碱基编辑器并结合重新设计的高分辨率屏幕，就可以追溯到在原始屏幕上被击中的近60个基因，以及一个包含近50000个向导的新库。聚焦于每个变异基因的热图，可以看出在低分辨率的NGG屏幕上仍然有很多盲区，即使开放阅读框，仍有很多氨基酸不能通过这个碱基编辑器发生突变。但是当研究人员使用高分辨率的屏幕时，更多的氨基酸可以被看到，为绘制这些蛋白质的功能区域提供了机会。比如在免疫失调综合症患者中发生突变的基因中，高分辨率屏幕不仅可以为大家展现出一些特殊的突变域，而这些突变反过来指明了传统生物化学方向没有指明的新的功能域，改变带有碱基边缘的氨基酸对细胞因子产生影响以及对原始人类T细胞下游效应影响将被清晰地捕捉。另外，在PI3KCD的高分辨率图谱上，PI3KCD以晶体结构被呈现出来，有一些低分辨率屏幕中被遗漏的位点得以显现，这些功能位点的增益被更好地描绘出来。基于此，绘制一个蛋白质和蛋白质界面的功能图将清楚地指导小分子放置位点以便调整T细胞的功能。

探索未来免疫疗法新方案

1、利用工程化蛋白开展研究：目前该团队正着眼于利用标签引入突变，表达后用质谱仪来观察蛋白质复合体，以明确相应的突变对蛋白质结构的影响。研究人员将其输入到已创建的集合系统中，测试个体方差的影响，进行详细的蛋白质组学研究。Alexander Marson教授希望能通过进行大规模蛋白质变异的发现，在更大范围内调整T细胞的功能来进行免疫治疗。

2、利用不同的正向遗传学开展研究：按照正向遗传学的理论基础，任何表现型均有其特定的通路。未来设计的免疫疗法可以进行全基因组筛选，通过删除或使用CRISPR工具过度表达来测试基因组中的每个基因，继而找到一系列重要的基因，放大这些基因内的核苷酸水平并观察单个核苷酸或氨基酸的影响。这个方法在编码区和非编码区均适用。当这些核苷酸水平的信息及组合方式被破译后，就可以开始考虑设计合成程序，在高通量下比较不同合成序列的效果，最终以此来制定未来免疫疗法方案，或者加速这种设计方案的实施。

小结

如果将遗传学作为如何编程细胞行为的基本逻辑，利用细胞疗法，破解其DNA密码，绘制精细图谱，为生物制剂设计蛋白质，赋予T细胞额外的特性，或者利用小分子进行信息传递，都可能成为有效的对抗癌症的新免疫疗法。一旦这些途径被有效破译，下一步就是考虑如何设计T细胞恶性肿瘤中缺乏的调控。

责任编辑：肿瘤资讯-云初
排版编辑：肿瘤资讯-云初