套细胞淋巴瘤（MCL）是一种B细胞受体（BCR）通路异常激活的不可治愈的非霍奇金淋巴瘤亚型。布鲁顿酪氨酸激酶（BTK）是MCL的一个已证实的靶点。BCR刺激后，BTK被激活，进而调节下游NF-κB通路和PI3K/AKT/mTOR通路。MALT1是BCR活化的NF-κB信号传导的重要调节剂，并具有2种内在功能——作为支架蛋白以及唯一的人半胱天蛋白酶。然而，对于MALT1在淋巴瘤的发生和由此产生的耐药性中的作用还知之甚少。
BTK抑制剂（BTKi）如伊布替尼（IBN）和Pirtobrutinib（PBN）已被证明可有效治疗MCL。然而，MCL患者在BTKi治疗后经常复发。最近的研究表明，非典型NF-κB信号传导与IBN耐药相关，PI3K/AKT/mTOR和整联蛋白信号传导也赋予MCL肿瘤微环境（TME）驱动的IBN耐药。然而，MALT1在BTKi耐药中的作用还没有很好地确定，并且需要找到一种能克服BTKi耐药的新疗法。
近期，The Journal of Clinical Investigation（JCI）杂志发表相关研究报告，其研究结果显示MALT1过表达与MCL中BTK抑制剂耐药相关，靶向异常MALT1活性可能是克服BTKi耐药的有前景的治疗策略，MALT1和BTK的共靶向或可改善MCL治疗的有效性和持久性以及患者预后。
研究结果
MALT1在IBN-R MCL细胞中过表达。BTKi如伊布替尼和BCL-2抑制剂如维奈克拉（VEN）已被证明对治疗MCL患者非常有效。然而，MCL患者对靶向治疗产生单一或双重耐药仍是常见的。为了研究这种耐药的潜在机制，研究人员对9个具有不同程度靶向药物敏感性的MCL细胞系进行了全转录组分析。
MALT1是全基因组转录组和所有NF-κB信号转导基因中表达差异最高的基因（DEG）之一，并且它在IBN-R细胞中的表达高于IBN-S细胞（P<0.001；图1，A-C）。MALT1表达在对IBN和VEN都有耐药性的细胞（Dual-R细胞）中也显著高于对两种药物都敏感的细胞（Dual-S细胞；P<0.001）（图1C）。有趣的是，编码MALT1上游结合配偶体的CARD11的表达在IBN-R MCL细胞中较低。
根据单细胞RNA测序分析，与IBN-S MCL细胞相比，原发性患者样本中的MALT1表达也有所升高（P<2.22×10-16；图1D）。此外，定量PCR显示，与健康PBMC相比，MALT1在原发性MCL细胞中的表达也更高（P<0.05）。与全转录组学分析一致，IBN-R和Dual-R MCL患者样本与IBN-S MCL患者样本相比表达显著更高水平的MALT1（分别为P<0.001和P<0.01；图1 E）。如图1F所示，高MALT1表达与较差的临床结果相关（P<0.05）。
MALT1在介导NF-κB和其他信号传导途径中至关重要。基因集富集分析（GSEA）显示，多种癌症信号标志物（包括MYC靶点、NF-κB信号传导和G2/M检查点）与IBN-R和Dual-R MCL细胞相关。重要的是，更深入的分析表明，在IBN-R和Dual-R细胞中，经典和非经典NF-κB信号在转录水平上均上调（图1G）。与IBN-S细胞相比，IBN-R细胞中NF-κB家族成员的活化进一步证实了这一点，表明NF-κB信号上调与MCL患者生存率较差相关。
图1. MALT1在伊布替尼耐药MCL细胞系和原代MCL细胞中过表达
MALT1在MCL细胞中充当IBN耐药性的致癌驱动因素。为了研究MALT1过表达如何赋予IBN耐药性，研究人员们首先评估了具有内源性IBN耐药性的JeKo BTK KD-1和-2细胞中以及具有获得性IBN耐药性的JeKo-R细胞中的MALT1蛋白水平。这些IBN-R细胞表达的MALT1蛋白水平高得多，即使CARD11蛋白以显著降低的水平表达。为了确定MALT1过表达是否与半胱天冬酶活性的增强相关，研究人员还检测了MALT1底物的裂解情况。更高的MALT1表达确实与其底物的增加的裂解增加呈正相关（图2A）。进一步证实了JeKo BTK KD-2细胞中的MALT1内源性裂解活性显著高于JeKo-1细胞中所观察到的（P<0.0001；图2B）。
在具有原发性IBN耐药性的MCL细胞系（图2C）和原发性患者MCL细胞中进一步验证了MALT1过表达及其升高的天冬氨酸蛋白酶活性。在24（P<0.05）、48（P<0.05）和72（P<0.001）小时测试的所有MCL细胞系中，MALT1 shRNA对MALT1表达的瞬时敲低（KD）导致显著的体外细胞增殖扰动（图2，D-F）。此外，与亲代JeKo-1细胞相比，在JeKo-MALT1细胞中由强力霉素诱导的MALT1的异位表达促进了第3至5天的细胞增殖（P<0.01）。提示MALT1作为BTK下游信号分子，对MCL细胞增殖起着重要作用。
接下来，研究人员使用CRISPR/Cas9技术从对MALT1或CARD11进行KO的JeKo-1和JeKo BTK KD-2细胞中产生稳定的细胞系。在所得细胞系中未检测到MALT1或CARD11蛋白（图2G）。与瞬时KD评估一致，MALT1的稳定KO导致JeKo-1和JeKo BTK KD-2细胞中细胞增殖受到显著抑制（P<0.0001）。相比之下，CARD11的稳定KO导致IBN-S JeKo-1细胞中的细胞增殖受到显著抑制，但IBN-R JeKo BTK KD-2细胞中的细胞增殖则没有（图2，H和I）。
在免疫缺陷的NSG小鼠中建立皮下细胞系衍生的异种移植物（CDX）模型。与体外细胞增殖试验一致（图2，H和I），MALT1 KO显著抑制了JeKo-1和JeKo-2以及JeKo BTK KD-2 CDX模型中的肿瘤生长和β-2-微球蛋白的血清水平（B2M），而CARD11 KO仅在JeKo-1 CDX模型1中抑制肿瘤生长和血清B2 M水平（图2，J-N）。这些数据表明，MALT1在驱动MCL肿瘤发生和IBN耐药性方面至关重要，它似乎绕过了上游BTK/CARD11信号的补偿机制。 
图2. MALT1在伊布替尼耐药MCL细胞中充当致癌肿瘤驱动因子
MI-2通过抑制NF-κB信号传导来阻断MALT1的半胱天冬酶活性和MCL细胞增殖。为了评估MALT1的半胱天冬酶活性的潜在作用，研究人员用MI-2处理MCL细胞。在JeKo-1、JeKo BTK KD-2和Z138细胞中，6小时MI-2处理以剂量依赖性方式抑制内源MALT1裂解活性（图3A）。用MI-2处理72小时后，在JeKo-1和JeKo-衍生的耐药细胞以及具有纳摩尔范围的半数最大抑制浓度（IC50）的其它细胞系中产生了有效的存活力损失（图3B）。处理24小时后，MI-2还有效地抑制对IBN有耐药性的原代MCL患者细胞的细胞活力。当在JeKo-1和JeKo BTK KD-2细胞中通过shRNA消除MALT1表达时，该活性丧失（图3C）。MI-2还诱导MCL细胞中强烈的凋亡，无论其IBN敏感性如何，在Jeko BTK KD-2和原发性MCL患者细胞中伴随着聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）和caspase 3的裂解（图3D）。为了进一步评估MI-2在体内抗MCL的效力，研究人员改造了JeKo BTK KD-2细胞以稳定表达荧光素酶报告基因，然后建立了JeKo BTK KD-2 CDX模型。结果显示，MI-2治疗（25 mg/kg，每天）显著抑制这些IBN-R CDX模型中的肿瘤生长（P<0.001；图3，E和F）。
图3. MI-2对MALT1的抑制降低了MALT1半胱天冬酶活性并抑制了MCL细胞中的增殖
经典和非经典NF-κB信号通路在IBN-R细胞中均上调（图1G），表明MALT1过表达可能是赋予其组成型激活的关键因素。为了验证上述猜测，研究人员采用了用MI-2或溶剂（二甲基亚砜，DMSO）处理6小时的JeKo-1和JeKo BTK KD-2细胞的无偏全转录组GSEA分析。并将NF-κB信号传导和相关炎症反应鉴定为MALT1抑制后最受下调的途径。本研究分析还显示，MALT1抑制抑制了这些细胞中的经典和非经典NF-κB信号传导（图4A）。通过测定JeKo-1（P<0.05）和JeKo BTK KD-2（P<0.0001）细胞中p65、p50、c-Rel、RelB和p52活性，进一步验证了这一点（图4，B和C）。在IBN-S细胞中，与非经典家族成员相比，经典NF-κB家族成员在MALT1抑制后受到更大程度的抑制。相反，在JeKo BTK KD-2细胞中，经典和非经典NF-κB家族成员均被显著抑制。
过量的ROS产生可引发细胞凋亡，NF-κB激活可减少ROS产生，从而促进细胞存活。MALT1抑制触发ROS途径和ROS产生的上调以及线粒体膜电位（ΔΨm）的损失，表明线粒体功能障碍在观察到的MI-2诱导的ROS产生中的作用。总之，这些数据表明，通过调节NF-κB活性和ROS通路，用MI-2靶向MALT1半胱天冬酶活性可有效克服MCL中IBN耐药性。 
图4. MI-2抑制MALT1可抑制MCL细胞中NF-κB信号传导
MALT1和BTK是MCL细胞在体内播散所必需的。一旦播散，MCL可累及一个或多个淋巴结、外周血（PB）、骨髓（BM）、脾、肝、胃肠道，甚至中枢神经系统。此外，据报道BCL10的MALT1依赖性裂解控制T细胞和MALT淋巴瘤的整联蛋白依赖性粘附。因此，研究人员推测MALT1可能通过MCL细胞和TME之间的相互作用介导细胞粘附和潜在的MCL播散。
为此，研究人员通过静脉注射使用有或没有MALT1或CARD11 KO的JeKo-1和JeKo BTK KD-2细胞建立了播散性CDX模型（图5A）。在使用JeKo-1细胞的CDX模型中，肿瘤细胞在脾脏、肝脏、BM甚至PB中显著蓄积，表明MCL播散至这些组织。在MALT1 KO的JeKo-1细胞中，观察到脾脏、肝脏、BM和PB中肿瘤细胞的频率显著降低（图5，B-I）。JeKo-1细胞中的BTK KD显示脾脏和BM中肿瘤细胞的存在相对减少，这在MALT1-KO细胞中也可以观察到（图5，C-F）。然而，BTK KD未导致PB或肝脏中肿瘤细胞的显著抑制（图5，B和G-I）。
图5. MALT1，而不是CARD11，对于MCL细胞向小鼠脾脏、肝脏和BM的播散至关重要
JeKo-1细胞中的CARD11 KO对PB中肿瘤细胞的存在显示出适度的影响（P<0.05），并且对脾脏、肝脏或BM中肿瘤细胞的发生率无明显影响（图5，B-G）。JeKo BTK KD-2细胞中的MALT1 KO似乎对脾或肝中的肿瘤负荷没有影响，因为这些细胞在这些位点的数量已经非常有限。然而，MALT 1基因敲除，而不是CARD11基因敲除，显示了BM和PB中肿瘤细胞发生率的额外显著降低。
接下来，研究人员使用含有95%或更多MCL细胞的患者单采样本进行了体内短期归巢试验。细胞用MI-2或DMSO预处理30分钟，然后在静脉注射到NSG小鼠之前洗涤。注射后1小时，两组PB中MCL细胞的百分比相似，但在药物预处理后4天，与对照组相比，MI-2组PB、脾脏和BM中MCL细胞的百分比显著降低。
为了评估MALT1抑制对MCL肿瘤播散的长期作用，研究人员通过静脉内注射IBN-R PDX细胞建立PDX模型。用MI-2而不是IBN治疗显著降低了脾脏、BM和PB中的肿瘤负荷（图5，J和K）。这些数据表明MALT1抑制在抑制IBN-R MCL肿瘤中的播散中是有潜在作用的。
MALT1抑制在体外有效抑制细胞PI3 K/AKT/mTOR信号传导、粘附和迁移。接下来，对培养的MCL细胞进行了无偏反相蛋白质阵列（RPPA）分析，以进一步了解MALT1驱动播散的可能机制。IBN-S和-R细胞用MI-2处理6小时并进行RPPA分析。许多参与PI3K/AKT/mTOR信号传导的分子，包括磷酸化的mTOR、rictor、AKT、P70-S6K和S6，在MI-2处理后在所有这些细胞中均显著下调（图6A）。
图6. MALT1抑制导致体外PI3 K/AKT/mTOR信号传导、细胞粘附和迁移受到抑制
据报道，PI3K/AKT/mTOR和整联蛋白-β1信号的激活对于TME驱动的IBN耐药性很重要，并在IBN-R细胞中得到证实。因此，假设MALT1通过调节PI3 K/AKT/mTOR和整合素-β1信号通路来调节MCL的播散。AKT、S6和p90 RSK的磷酸化在JeKo-1衍生的IBN-R细胞系中上调（图6B）。当用抗IgM刺激JeKo-1细胞5分钟以诱导BCR触发的PI3 K/AKT/mTOR信号传导时，MI-2预处理1小时可有效阻断PLCγ2、BTK和AKT的磷酸化和活化（图6C）。因此，MI-2处理还导致所有检测的MCL细胞系中细胞内ATP水平呈剂量依赖性降低（图6D）。
全转录组分析显示顶端连接调节是MALT1抑制后显著下调的最重要癌症标志之一。除顶端连接调节外，进一步分析显示MALT1抑制抑制了参与MCL播散的多个途径，包括细胞粘附分子、粘着斑复合物和粘附连接蛋白。DEG分析显示，在JeKo-1和JeKo BTK KD-2细胞中，多种整联蛋白信号传导分子和细胞粘附分子在MALT1抑制后被下调（图6，E和F）。这些蛋白中的大多数可直接或间接调节整联蛋白介导的信号传导和细胞粘附。
为了进一步解决这个问题，接下来筛选了细胞外基质（ECM）成分。在8种ECM成分中，研究人员确定纤连蛋白和层粘连蛋白是MCL细胞系中参与细胞粘附的主要ECM因子；有趣的是，与IBN-SJeKo-1细胞相比，IBN-R细胞（JeKo-R、JeKoBTKKD-1和JeKoBTKKD-2）显示出对纤连蛋白、层粘连蛋白和牛血清白蛋白显著更高的细胞粘附。MI-2处理降低了MCL细胞对纤连蛋白、层粘连蛋白和胎牛血清（FBS）的粘附，尤其是对于IBN-R MCL细胞（图6，G和H）。此外，MI-2处理降低了MCL细胞通过Transwell插入物迁移至预先接种的HS-5基质细胞单层的能力（图6I）。MCL细胞通过Transwell插入物向基质细胞迁移的能力比从HS-5基质细胞培养物中收获的培养上清液更强（P<0.0001；图6 J），表明HS-5诱导的细胞迁移需要MCL-基质细胞接触。总之，这些数据表明MALT 1在介导细胞粘附、迁移和播散中起重要作用。
MALT1和BTK的共靶向在体外和体内克服了IBN耐药性。为了筛选具有克服IBN抗性潜力的组合疗法，研究人员用MI-2与超过10种FDA批准或正在研究的药物组合来处理MCL细胞。其中，MI-2联合IBN对2份IBN-R患者样本和1份IBN-R PDX样本显示出最大的抗MCL效力（图7A）。使用MCL细胞系和其他患者和PDX样本进一步验证了这一点（图7B）。与此一致，MI-2和IBN组合显著诱导JeKo-1和JeKo BTK KD-1和-2细胞中的细胞凋亡，其高于任一单一药剂。
图7.BTK和MALT1的双重靶向在对BTKi耐药的MCL细胞中促进有效的抗MCL活性
无偏倚RPPA谱显示MI-2和IBN组合诱导对JeKo-1和JeKo BTK KD-2细胞的蛋白谱的协同作用（图7C）。联合给药抑制的主要癌症标志为PI3 K/AKT/mTOR信号传导、顶端连接蛋白、G2/M检查点蛋白和E2 F靶蛋白，而细胞凋亡和缺氧是上调的主要癌症标志（图7D）。与单一药剂或溶剂相比，在用MI-2和IBN组合处理的JeKo-1和JeKo BTK KD-2细胞中，通过Western印迹进一步证实PI 3 K/AKT/mTOR和NF-κB信号传导显著下调（图7 E）。在IBN-R细胞中，MI-2与PBN的组合也显示出比任一单一药剂更强的抗肿瘤活性（P<0.0001）（图7F）。值得注意的是，已证明JeKo-R和JeKo BTK KD-2对PBN具有耐药性。
对于合理的治疗开发，研究人员接下来测试了另一种MALT1抑制剂，即Safimaltib，其不仅在IBN-S细胞中，而且在IBN-R和PBN-R细胞中均显示出有效的抗MCL活性。此外，Safimaltib与IBN或PBN组合在体外对JeKo-R细胞具有高度协同作用（图7G）。此外，50 mg/kg/天的Dafimaltib与30 mg/kg/天的PBN联合给药显著抑制IBN-R PDX模型的肿瘤生长（P<0.01），并延长小鼠存活期（P<0.05），超过任一种单药治疗所观察到的结果（图7H和I）。在本实验期间，单药或联合给药均未观察到对体重的影响。总之，这些数据表明MALT1和BTK的共靶向有望克服MCL对BTKi的耐药性。
结论
MALT1的KO或药理学抑制减少了MCL细胞增殖和存活，无论IBN的敏感性如何，这表明MALT1与MCL存活力密切相关。PBN的近期临床数据表明，BTK在许多共价BTKi耐药患者中仍具有靶向性。因此，MALT1和BTK的双重靶向可大大改善患者的临床结局，无论是BTKi治疗的初治患者还是既往治疗失败的患者。
在BTKi敏感细胞中，双重靶向可关闭MCL细胞存活、增殖、粘附和播散所需的NF-κB和PI3 K/AKT/mTOR信号传导。相反地，在BTKi耐药性细胞中，MALT1变得异常表达并因此促进细胞存活和增殖，同时赋予TME介导的BTKi抗性作为替代性补偿机制。因此，BTK和MALT1的双重靶向阻断了MCL中治疗耐药性发展的多种适应性机会。基于此，本研究认为这可以最终防止治疗复发，并提高MCL患者的无病生存率。
Vivian Changying Jiang, Yang Liu, Junwei Lian, et al; Cotargeting of BTK and MALT1 overcomes resistance to BTK inhibitors in mantle cell lymphoma; J Clin Invest.2023 Feb 1;133(3):e165694.
doi: 10.1172/JCI165694.
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