急性髓系白血病（AML）是一组异质性的造血克隆性疾病，随着对其分子认识的进步、靶向治疗的可用性以及异基因造血干细胞移植（allo-HCT）的广泛应用，部分AML取得较好预后，但预估5年总生存率（OS）也只有30%。白血病干细胞可持续存在并影响正常造血祖细胞的骨髓（BM）微环境，使得微环境有助于白血病发生发展，影响白血病治疗反应，促进复发。最近AML的治疗研究重点是如何克服耐药，恢复免疫监视，其中靶向BM微环境是很有前途的治疗策略。
BM微环境中的白血病细胞：诱导耐药和免疫逃逸
BM白血病细胞分级类似于正常造血，金字塔顶端是小部分白血病干细胞（LSCs），LSCs并非正常未成熟造血干细胞（HSCs），而是获得驱动突变的定向祖细胞。虽然LSCs从CD34+CD38-细胞中富集，但其表型尚不完全明确。与正常HSCs相比，LSCs表达更高的CD25、CD32、CD44、CD96、CD123、CD200、GPR56、N-cadherin、Tie2、TIM-3、CLL1、c-MPL和HDM2，但个体间和个体内的高度异质性使其定量和连续监测很困难。
研究证明，诊断时或治疗后的LSCs频度具有不良预后作用。LSCs归巢BM微环境并保持静止，可逃避抗白血病药物的作用，子代白血病细胞逐渐占据BM微环境，将其转变为适合白血病的微环境，支持白血病细胞生存和增殖，降低维持正常造血能力。
白血病细胞对BM微环境的影响包括微环境中的所有成分。影响LSCs锚定内皮细胞，促进白血病细胞在具有保护性的BM微环境中浸润，促进AML进展和髓外归巢；微环境中表达Nestin的细胞可增强谷胱甘肽-过氧化物酶活性进而诱导化疗耐药；脂肪细胞通过分泌SCF参与放疗或5FU治疗后的造血恢复，隔离、灭活和代谢化疗药物；髓系来源的抑制细胞（MDSCs）和白血病相关巨噬细胞（LAMs）与AML的免疫抑制性微环境形成相关。
BM AML细胞通过几种策略来逃避免疫监视，包括表观遗传下调HLA分子、HLA分子丢失、免疫抑制/抑制性分子产生增加、抑制性配体表达增加、表达检查点抑制剂、改变NK细胞配体表达、T细胞形成免疫突触能力受损、诱导Tregs和MDSCs扩增以及巨噬细胞M2极化。具体如图1。
图1 AML中抗肿瘤免疫监视逃逸的机制模式图
许多针对AML的免疫治疗正在研发中，包括靶向LSCs限制性抗原，免疫检查点抑制剂重新激活内源性T细胞反应，通过连接抗体和工程化T细胞（CAR-T）以TCR非依赖方式激活T细胞和NK细胞反应等，上述治疗与现有治疗联合也是重要的治疗发展方向。
单克隆抗体
1.LSCs的潜在靶点
非偶联抗体的主要作用机制是抗体依赖细胞介导的细胞毒作用（ADCC），与靶细胞形成免疫突触后，NK细胞将含有穿孔素和粒酶的颗粒胞吐进入目标细胞，导致细胞溶解。还可通过巨噬细胞促进抗体依赖的吞噬作用（ADCP）。非偶联抗体的局限性是激活信号作用有限，且可被抑制性信号抵消。
1.1 CD33
CD33是67 kDa糖蛋白，是siglec家族成员，正常的早期髓-单核定向祖细胞到成熟细胞均有表达，也表达于99%AML细胞和LSCs。非偶联CD33抗体治疗的挑战在于CD33表达密度低，抗体诱导内化作用差。首个人源化IgG1非偶联CD33抗体lintuzumab（HuM195）的III期研究因缺乏疗效而终止。目前仍有4项I/II期研究正在评估新的CD33非偶联IgG1抗体（BI 836858），单独或联合阿扎胞苷（AZA）、地西他滨（DAC）或F16-IL2治疗复发/难治（R/R）和新诊断（ND）AML。
抗体-药物偶联剂（ADC）的主要优点是选择性攻击目标细胞并定向释放细胞毒药物。抗CD33-calicamycin偶联剂gemtuzumab-ozogamicin（GO）现已用于CBF AML、老年AML或高危MDS治疗，可减少良好/中等细胞遗传学风险患者的复发风险，延长生存。I期研究正在评估GO+维奈克拉（VEN）治疗成人R/RAML的安全性和疗效。新的抗CD33抗体偶联DGN462（DNA烷化剂）的临床前研究显示出活性，治疗CD33+R/RAML的I期研究结果尚未公布。
1.2 CD123
CD123是IL-3受体α链，I型跨膜糖蛋白，表达于98%CD34+CD38-LSCs和原始细胞，不表达于正常造血祖细胞。非偶联抗体talacotuzumab未能证明对AML和MDS有效。正在招募的I/II期研究中，CD123-DGN462 ADC单独或与AZA±VEN联合治疗诱导后MRD+AML。
1.3 CLL1
C型凝集素受体1（CLL1）位于12p13.31，是含有ITIM的抑制性跨膜蛋白。正常HSCs不表达CLL1，定向祖细胞和成熟外周髓系细胞表达CLL1，LSCs也选择性表达CLL1，密度甚至高于CD123，因此是LSCs免疫治疗的理想靶点。CLL1与配体结合后虽可有效内化，但体外研究表明，CLL1非偶联抗体不能诱导ADCC，不具有抗白血病活性。动物模型中，二种偶联DCCL9718A和CLT030的ADC可诱导有效的抗白血病作用，几无脱靶毒性。为了增强抗CLL1疗效，双特异性抗体和细胞治疗正在研发中。
1.4 其他ADC
FLT3是III类受体酪氨酸激酶家族成员，对维持正常HSCs生存非常重要。FLT3高表达于AML和ALL原始细胞，许多AML发生FLT3再现性突变。动物模型研究表明，FLT3敲除动物的造血功能几乎正常，而FLT3突变则具有生长优势，提示选择性抑制FLT3可阻止FLT3过度激活，且对正常造血影响较小。成人R/RAML采用FLT3抗体AGS62P1（amberstatin269）治疗的I期研究因缺乏疗效而终止。
靶向转铁蛋白受体的INA03 ADC的I期研究显示治疗有效。评估维布妥昔单抗治疗CD30+R/RAML的研究结果尚未公布。放射性核素标记单抗可精确地对疾病部位放疗，特别是HCT预处理时，既保持了高剂量全身照射（TBI）的优势，又无过高毒性，III期SIERRA研究比较了常规清髓和131-I-BC8治疗（碘偶联CD45抗体），前25%患者的初步结果证明了该治疗的可行性，但毒性降低并不显著。NCT03867682研究拟评估核素标记的CD33抗体偶联剂225-Ac-Lintuzumab+VEN治疗成人R/RAML的最大耐受剂量和缓解率，I期NCT03441048研究拟评估CLAG-M+211-At-BC8治疗R/RAML的毒性，二项I/II期研究拟评估211-At-BC8+氟达拉滨+环磷酰胺+2GyTBI或211-At-BC8+氟达拉滨+2-3GyTBI预处理拟行单倍体HCT R/RAML的毒性、GVHD发生率、供体嵌合、植入率和100天生存率。这些研究结果将为个体化治疗降低毒性提供更多信息。
2.免疫检查点抑制剂
免疫系统活性由共抑制分子及其配体的相互作用进行调节。共抑制分子参与免疫耐受维持，但在肿瘤情况下则是肿瘤逃避免疫监视的机制之一。许多研究报告，实体肿瘤和AML的共抑制分子表达增加，并与不良预后相关，因此成为新的治疗靶点（图2）。阻断不同共抑制分子的药物，如伊匹单抗、帕博利珠单抗、cemiplimab、阿维鲁单抗和度伐利尤单抗，正在进行治疗AML的研究。单药治疗虽可阻断共抑制分子，改善免疫反应，但疗效并不显著，这促进了联合治疗研究。
图2 维持免疫耐受的主要机制和潜在治疗靶点
2.1 CTLA-4/B7
CTLA-4（CD152）是免疫球蛋白相关受体成员，与配体CD80和CD86相互作用，传递抑制信号终止免疫反应。参与诱导Treg，在调节免疫耐受和自身免疫中发挥关键作用。有研究显示，CTLA-4在AML异常表达，并与其他检查点抑制剂表达相关，对疾病有不良影响。小鼠肿瘤模型中，阻断CTLA-4可增强T细胞活性，抑制Tregs。黑色素瘤临床研究显示，抗CTLA-4药物伊匹单抗可增加Teff/Tregs比率，增强NK活性，恢复效应T细胞功能，延长生存。AML细胞系体外研究和初步临床研究证实了实体瘤的研究结论。Davids报道，伊匹单抗单药治疗血液恶性肿瘤HCT后复发患者，完全缓解率（CR）23%，部分缓解率（PR）9%。一项I期研究正在探索伊匹单抗+供体淋巴细胞输注（DLI）治疗HCT后复发AML和MDS。
2.2 PD1/PDL1
PD1（CD279）是I型跨膜蛋白，几乎在所有激活免疫细胞中优先表达，配体包括PDL1（CD274）和PDL2（CD273）。PDL1是共刺激/共抑制分子B7家族成员，表达于造血细胞。PDL1和PDL2过表达与肿瘤不良预后相关，PD1/PDL1结合产生抑制性信号，T细胞耗竭，利于肿瘤细胞免疫逃逸，诱导肿瘤特异性细胞凋亡，促进Tregs分化，抵抗CD8+细胞介导的溶解。AML进展时，效应T细胞和Treg的PD1上调，表明免疫抑制加重。
PD1和PDL1抑制剂尚未批准用于AML治疗。Kadia的II期研究的初步结果显示，诱导巩固治疗后CR的高危AML使用纳武利尤单抗维持治疗，CR率79%。AZA+纳武利尤单抗治疗R/RAML的CR/Cri 21%，血液学改善7%，中位OS 9.2个月，2-4级irAEs 28%。纳武利尤单抗+阿糖胞苷+去甲氧柔红霉素治疗NDAML和MDS的II期研究中，CR/CRi 72%，4和8周死亡率稳定于6%。
2.3 TIM-3/Galectin-9
TIM-3位于5q33.2，与IL-4和IL-5在同一区域，表达于CD4+TH1细胞、CD8+细胞毒T细胞以及其他固有免疫细胞。TIM-3有4个配体，其中Galectin-9发现最早研究最多，能诱导TH1细胞凋亡，对肿瘤细胞免疫逃逸至关重要，高表达与预后较差相关。AML中免疫细胞高水平表达TIM-3，LSCs也表达TIM-3，与配体结合后形成调节LSCs发育和生存的自分泌环，因此TIM-3是优秀候选靶点。几个TIM-3单抗正在进行实体瘤治疗研究，如MBG453（sabatolimab）、TSR-022、BMS986258、LY3321367、SYM023、BGB-A425和SHR1702，只有MBG453在AML和MDS中显示出初步疗效和安全性。MBG453+HMAs研究的中期数据显示，MBG453+DAC组MDS和NDAML的ORR为58%和48%，MBG453+AZA组为70%和27%，最常见3/4级AEs为血小板减少、贫血、中性粒细胞减少和发热性中性粒细胞减少，MBG453+DAC组报告了4个irAEs，MBG453+AZA组无。
2.4 LAG-3/MHC
LAG-3（CD223）是CD4样分子，表达于激活的T细胞、Tregs、NK细胞、B细胞和树突细胞，与配体结合后降低T细胞活性和细胞因子分泌，阻断T细胞激活和功能。LAG-3的功能可能与PD1相似，但对AML影响的研究有限。靶向LAG-3的抗体正在实体瘤、淋巴瘤和多发性骨髓瘤中进行评估，尚无AML的临床研究。
2.5 CD200/CD200R
CD200是LSCs标志，高度保守的48kDa1型跨膜糖蛋白，结构上与B7家族相关，位于3q12-q13，毗邻CD80/CD86编码区。与配体CD200R相互作用导致许多免疫效应减弱，能延长allo-HCT生存，也导致对肿瘤细胞耐受。部分实体瘤和AML的CD200过表达，与不良预后相关，源于其抑制记忆T细胞功能，增加Tregs，下调NK功能。小鼠模型表明，单抗抑制CD200/CD200R可恢复抗白血病免疫反应。目前抗CD200单抗samalizumab正在进行实体瘤研究，尚无AML相关研究。
2.6 CD47/SIRPs
白细胞表面抗原CD47是跨膜糖蛋白，位于3q13.12，是SIRPα的配体（吞噬细胞表达），CD47激活后启动信号转导级联，抑制吞噬作用。CD47广泛表达于多种正常组织、正常外周血HSCs和白血病细胞，白血病细胞表达CD47与预后不良相关。临床前研究表明，阻断CD47具有抗肿瘤作用。
Magrolimab是首个用于临床的CD47单抗，2020年获批突破性治疗，其关键研究中高危MDS采用magnorumab+AZA治疗安全性良好，最常见TEAEs包括便秘、血小板减少、贫血、中性粒细胞减少、恶心和腹泻，CR和ORR为33%和76%，12和24个月OS率75%和52%，TP53突变（40%）和WT TP53患者（31%）均获良好结果。比较magrolimab/安慰剂+AZA治疗MDS的III期ENHANCE研究正在招募。1b期研究报告magrolimab+AZA一线治疗TP53突变AML，具有相似的耐受性和安全性，常见TEAEs为便秘、腹泻、发热性中性粒细胞减少、恶心、乏力、食欲下降、血小板减少、外周水肿和咳嗽，ORR 48%，CR 33.3%，CRi 8.3%，30和60天死亡率8.3%和18.1%，中位OS 10.8个月，TP53突变不适合强化治疗的高危AML可持久缓解，OS令人鼓舞。III期ENHANCE2研究比较该联合方案与标准方案治疗TP53突变AML，正在进行中。另一II期研究采用magrolimab+AZA+VEN、magrolimab+强化疗和magrolimab+口服AZA治疗。2022ASH中I/II期研究报告，74例老年ND ELN高危AML采用magrolimab+AZA+VEN治疗，ORR 74%，CR/CRi 63%，4-8周死亡率0%，贫血是主要血液学AE，最常见非血液学AEs为发热性中性粒细胞减少、肺炎、高胆红素血症和转氨酶升高。III期ENHANCE3研究将进一步评估该治疗对ND AML的疗效。
Evorpacept（ALX148）是工程化的高亲和力的CD47阻断蛋白，其Fc结构经过修饰可避免magrolimab所致的红细胞凝集。目前ASPEN02和ASPEN05研究正在评估ALX148+AZA治疗高危MDS和ALX148+AZA+VEN治疗AML。I期研究结果显示evorpacept+AZA耐受性良好，TEAEs包括便秘、输液相关反应和恶心呕吐，无evorpacept相关SAEs，无患者因AEs停止治疗。
3. T细胞连接剂
非偶联抗体和ADC治疗AML的结果并不理想，目前正在发展联合策略提高疗效。T细胞连接剂在靶向特定肿瘤抗原同时连接效应细胞（T细胞、NK细胞、巨噬细胞），以执行抗白血病免疫反应，不但能获得快速有效的细胞毒反应，理想情况下还能产生持久的免疫记忆。目前已有几个血液恶性肿瘤的双特异性T细胞连接（BiTE）抗体，新的连接剂还在不断出现。BiTE抗体可识别肿瘤相关抗原可变区和CD3，结合后T细胞持续暴露于肿瘤抗原并被激活，可能克服抗原低表达。
T细胞仅在目标细胞存在时才被激活，因此脱靶毒性有限。此外，BiTEs以MHC-1非依赖方式发挥作用，即使肿瘤诱导MHC-1下调，CD8+T细胞也能形成溶细胞突触，即使缺少CD28或IL-2等共刺激信号也能激活T细胞。从贝林妥欧单抗开始，已研发多个BiTEs，结构变体包括双亲和重定向（DARTs）抗体以及双特异性和三特异性杀伤连接剂（BiKEs和TriKEs）。BiTEs由一个连接分子连接，该连接分子决定了BiTEs的适应性和抗原结合动力学。DARTs包括一个c端二硫键桥以提高稳定性，增强T细胞激活和细胞溶解。BiKEs和TriKEs通过CD16连接NK细胞激活免疫系统，释放细胞因子，导致肿瘤细胞溶解并招募其他免疫细胞放大免疫反应。此外，TriKes还有一个IL-15连接，可增加NK扩增和杀伤反应。
3.1抗CD33
临床前研究表明，CD33与AMG330 BiTE结合后，激活T细胞，释放细胞因子，高效清除原始细胞，减少BM髓系来源的抑制细胞（MDSCs）。AMG330的溶解细胞活性不受CD33多态性影响，也不受AML细胞药物转运蛋白过表达影响，而且不改变CD33表达密度。I期剂量研究中，55例R/RAML，8/42（19%）获CR，最常见AEs是细胞因子释放综合征（CRS）和恶心。
AMG673是CD3-CD33 BiTE，其Fc经修饰后半衰期延长，允许每周输注。I期研究中，虽只有1例R/RAML达CR，但44%患者的白血病负荷减少，50%发生CRS，其他AEs包括转氨酶升高、白细胞减少、发热性中性粒细胞减少和血小板减少。
AMV564是CD3-CD33 BiTE，动物模型显示具有抗白血病作用。R/RAML的I期研究中，通过激活T细胞发挥抗白血病作用，与抗原表达水平无关，并以剂量依赖方式去除MDSCs。18例患者的初步结果显示，毒性可接受，1例2级CRS，7/18例发热性中性粒细胞减少。
G333是新型CD3-CD33 BiTE，连接剂经修饰后增加T细胞与AML细胞的结合能力。临床前研究表明对正常HSCs影响较小，R/RAML的I期研究正在进行。JNJ-67571244是CD3-CD33 BiTE，R/RAML和高危MDS 的I期剂量递增研究结果尚未公布。GTB-3550是CD16-CD33 BiKE，临床前研究证明通过克服MHC-1抑制信号发挥抗白血病作用，并逆转MDSCs诱导的NK细胞抑制，R/RAML、MDS和晚期系统性肥大细胞增多症的I期研究正在进行。
3.2抗CD123
Vibecotamba（XmAb14045）是CD3-CD123 BiTE，临床前模型显示具有高度抗白血病活性，半衰期较长。104例R/RAML的I期剂量递增研究的初步结果显示，ORR 14%，CR率4%，71%疾病稳定，59%CRS。AML细胞的CD123表达密度似不影响治疗。APVO436也是CD3-CD123 BiTE，目前正在进行AML和MDS的临床研究。其特征是激活T细胞同时较少诱导细胞因子释放，但初步结果显示疗效有限。
Flotetuzumab（MDG006）是CD3-CD123 DART，R/RAML的I/II期研究显示具有抗白血病活性，中位OS 10.2个月。体外研究显示，flotetuzumab应用后PD1/PDL1上调。已证明MGD006在低剂量下优先结合白血病细胞，促进原始细胞溶解，并能维持BM细胞密度和HSCs组成。
双靶三体SPM-2，靶向CD33和CD123，通过CD16连接NKs作为效应细胞，纳米浓度下就可溶解AML细胞，预期SPM-2能根除LSCs。2022ASH有临床前研究显示，抗CD123和CD200前药三特异性T细胞连接剂靶位激活，可杀死AML细胞，去除LSCs，并最大限度减少靶向非抗白血病毒性。
3.3其他靶点
MCLA-117是CD3-CLL1 BiTE，半衰期较长，可每周或每2周治疗，目前正在进行R/RAML和老年NDAML的I期研究。体外研究表明，低效应细胞：靶细胞比情况下，MCLA-117就可溶解细胞（包括CLL1低表达原始细胞）。CLL1 TriKE用于靶向缺乏CD33表达但表达CLL1的LSCs，脱靶毒性较少，与靶向CD33具有相似的溶解能力，并可保留正常HSCs。AMG427是CD3-FLT3 BiTE，体外证明具有T细胞依赖性细胞毒作用，但增加PD1表达，不同时使用抗PD1治疗可促进免疫逃逸。2022ASH报道了ISB1442的临床前评估结果，ISB1442是首个CD38和CD47 BiTE，用于治疗AML和T-ALL，能够杀死来自患者的初代肿瘤细胞。
所有的双特异性抗体均处于早期临床研究阶段，安全性可接受，但同时也有很多不足。首先，双特异性抗体的理想形式仍不明确；半衰期短，需要连续输注和频繁的剂量调整；结构修饰增加分子量虽可阻止肾脏快速清除延长半衰期，但可能增加脱靶毒性；第二，抗体本身可诱导抑制性共刺激分子上调，减少T细胞激活，利于肿瘤生长，同时PD1抗体治疗可能有助于克服这一不足；最后，白血病细胞的最佳靶点还未确定。
T和NK细胞治疗
CAR-T细胞是经过改造的自体外周T细胞，表达合成的目标抗原受体（CAR），与目标抗原结合后启动细胞内信号，非TCR依赖性T细胞激活和目标抗原依赖性扩增，并形成长期抗白血病记忆。CAR包括四个主要组成部分，均可影响CAR-T功能：（1）胞外目标抗原结合域；（2）铰链域；（3）跨膜域；（4）一个或多个胞内信号域。
胞外域不仅对抗原识别很重要，对结合亲和力和特异性也至关重要，过低或过高亲和力都可能诱导CAR-T细胞发生激活诱导细胞死亡（AICD）并引发毒性。铰链区的适应性允许抗原结合域进入目标表位并形成免疫突触，最常使用的铰链区衍生自CD8、CD28、IgG1和IgG4。跨膜域影响CAR的表达水平和稳定性，多数跨膜域源自天然蛋白，包括CD3ζ、CD4、CD8α和CD28。CD3ζ跨膜域可促进T细胞激活，介导CAR二聚，与内源性TCRs结合，但不如CD28ζ域稳定。铰链域和跨膜域影响CAR-T细胞产生细胞因子和AICD。胞内域影响CAR-T细胞激活程度和持久性
第一代CAR-T细胞为单一信号域（CD3ζ），较新的CAR-T细胞还具有共刺激结构，第三代CAR-T细胞具有CD28plus、CD137或CD134。CAR-T细胞治疗的挑战是高度抑制的微环境以及正常造血细胞也表达目标抗原。目前有20多项研究正在进行，目标抗原包括CD33、CD123、CLL1、CD38、NKG2D和CD7。
几乎所有AML亚型都表达CD33。一项中国研究评估了CD33 CAR-T治疗的可行性，具有潜在获益，但副作用严重。
CD123 CAR-T细胞体外显示出强大的抗白血病活性，由于CD123很难区分白血病细胞和正常造血细胞，因此限制了其应用。CD44v6是粘附蛋白，利于白血病发生并有助于LSCs表型，CD44v6 CAR-T细胞体外抗白血病作用强大，并保留正常HSCs，I期研究正在评估其可行性和安全性。CLL1也作为CAR-T细胞的目标抗原，体外研究和小鼠模型显示了令人鼓舞的结果，可较好区分正常和白血病细胞，CD33-CLL1双CAR-T细胞的I期研究已经启动，初步结果显示，7/9例MRD阴性。Cui研究了CD38 CAR-T细胞治疗allo-HCT后复发AML的安全性，输注4周后4/6例达CR/CRi且毒性可控，LFS 7.9个月。CD33和IL-15 CAR-T治疗R/RAML和高危MDS的I期剂量研究显示，ORR 50%，安全性和耐受性良好。临床前研究采用FLT3 CAR-T细胞和FLT3抑制剂吉列替尼双重靶向治疗FLT3突变AML，可有效清除白血病细胞并保留正常HSCs。Appelbaum采用可控CD33 CAR-T细胞（SC-DARIC33）治疗R/R CD33+AML，此细胞输注后可通过间断使用雷帕霉素进行控制调整。
靶向不同AML细胞抗原（CD70、CD33和FLT3、CLL1）的NK CAR细胞在体外表现出强大的抗白血病作用，细胞毒作用强大，脱靶毒性有限，识别机制独特，目前正处于临床前评估阶段。
CAR-T细胞有望彻底改变血液恶性疾病的治疗，但还有许多障碍有待克服。对于AML，理想的LSCs目标抗原应更具特异性，所有疾病阶段持续表达，且易于监测。CAR-T细胞生产需要改进，以提高目标抗原识别，确保结合强度足够激活T细胞且不引起AICD，限制脱靶毒性和延长CAR-T细胞持久性。
Damiani D, Tiribelli M. Present and Future Role of Immune Targets in Acute Myeloid Leukemia. Cancers (Basel). 2022;15(1):253. doi:10.3390/cancers15010253
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