细胞代谢重编程被认为是癌症的标志之一。氨基己糖通路（HBP）在细胞中作为“能量传感器”调节代谢通量。谷氨酰胺-果糖-6-磷酸酰胺转移酶1（GFAT1）是HBP的限速酶，在人类癌症中被广泛发现表达升高，但目前对于其在肿瘤发生中的确切和具体作用仍不清楚。p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）是应激信号通路的重要组成部分，在细胞命运决定（cell fate decision）中起关键作用，而目前对于其在营养压力下激活的潜在机制也仍不明确。
近期，由广州医科大学第一附属医院陈涛、梁文华及钟南山领衔的团队，与上海交通大学医学院附属仁济医院蒋玉辉团队合作，于Cell Discovery（IF=38.079）发表了一篇题为“GFAT1-linked TAB1 glutamylation sustains p38 MAPK activation and promotes lung cancer cell survival under glucose starvation”的研究报告，他们发现葡萄糖剥夺以TAB1 S438磷酸化依赖性方式诱导GFAT1与转化生长因子β活化激酶1结合蛋白1（TAB1）的相互作用。而GFAT1与TAB1的结合促进了TTLL5–GFAT1–TAB1复合物的形成，GFAT1对谷氨酸盐生成的代谢活性进一步促进了TTLL5介导的TAB1谷氨酸化。因此，TAB1谷氨酸化促进p38αMAPK的募集，从而驱动p38MAPK活化。在生理学上，GFAT1-TAB1-p38信号促进自噬发生，从而保护葡萄糖缺乏下的肿瘤细胞存活。临床分析表明，GFAT1和TAB1 S438磷酸化水平，均与肺腺癌患者的不良预后相关。这些发现揭示了营养压力下代谢酶调节p38MAPK信号的未知机制，并为肿瘤治疗中新靶点——GFAT1的发现提供了理论支持。
GFAT1促进缺糖条件下p38MAPK活化和细胞存活
癌症基因组图谱（TCGA）和基因型-组织表达（GTEx）数据库的基因表达谱交互分析（GEPIA）表明，与癌旁正常组织相比，GFAT1在肺腺癌标本中大量上调（图1a）。基于此，为了确定GFAT1在肺腺癌肿瘤发生中的具体功能，研究者首先在营养压力下检测了肺腺癌细胞系A549和H1299中GFAT1缺失的影响。CRISPRCas9系统缺失GFAT1导致葡萄糖剥夺而不是谷氨酰胺剥夺下细胞存活率急剧下降（图1b），这与延长葡萄糖剥夺过程中GFAT1的表达升高而延长谷氨酰胺剥夺下GFAT1的表达减弱的观察结果一致。
为了检测这种生理效应是否与葡萄糖剥夺时的典型反应信号有关，研究者检测了AMPK、p38MAPK和JNK的活化状态。有趣的是，GFAT1缺失只抑制葡萄糖剥夺诱导的p38MAPK激活，表现为p38MAPK Thr180/Tyr182磷酸化和下游MAPKAPK2 Thr222磷酸化（图1c）。时程分析表明，GFAT1缺失对p38MAPK活化的负面影响在早期轻度出现，在晚期时间点达到突出程度（图1d），而MKK3/6和MKK4（已知磷酸化p38MAPK的上游激酶）的活性不受GFAT1缺失的显著影响，无论葡萄糖的可用性如何，提示了在这种情况下p38MAPK激活的替代机制。同时，用p38MAPK抑制剂BIRB796处理A549或H1299细胞导致葡萄糖剥夺下细胞生长明显受损（图1e）。值得注意的是，过表达可导致p38活化的MMK6组成型活化形式MKK6E，可以显著恢复GFAT1缺失时的细胞生长（图1f），提示导致p38激活的替代方式也可以支持葡萄糖剥夺下的细胞存活。
为了知道GFAT1对p38MAPK的调节是否归因于其代谢活性，研究者用CRISPR-Cas9抗性WT GFAT1（WT rGFAT1）或酶失活突变体GFAT1-H577A（rGFAT1H577A）重建GFAT1缺失的A549细胞。在葡萄糖剥夺条件下，发现GFAT1缺失抑制的细胞生长被WT rGFAT1显著挽救，而不是被rGFAT1-H577A表达挽救（图1g）；在裸鼠肿瘤生长分析中也验证了类似的效果（图1 h），揭示了GFAT1的代谢活性在细胞生长中的重要性。GFAT1在HBP途径中直接催化谷氨酰胺转化为谷氨酸产生葡糖胺-6-磷酸（GlcN6P）（图1i）。
酶学检测显示rGFAT1-H577A表现出明显的酶活性下降。同时，A549细胞中GFAT1缺失或 rGFAT1-H577A表达明显减弱了细胞整体O-GlcNAcylation水平，加入高剂量外源性葡糖胺（GlcN）可有效逆转该作用。
然而，外源性GlcN补充并没有显示出对葡萄糖缺乏下GFAT1缺陷或rGFAT1-H577A表达细胞中p38MAPK磷酸化或细胞生长的良好挽救作用（图1j），表明单独增强细胞O-GlcNAcylation不足以驱动GFAT1缺失时的细胞生长。与这一观察结果相反，加入外源性谷氨酸意外地逆转了rGFAT1-H577A表达细胞而不是GFAT1缺陷细胞中抑制的细胞生长以及p38MAPK激活（图1j，k）。值得注意的是，GFAT1缺失对细胞内谷氨酸和谷氨酰胺水平没有影响，与葡萄糖可用性无关。这些结果表明，谷氨酸生成的GFAT1代谢活性，而不是促进O-GlcNAcylation途径的GlcN6P形成，对于葡萄糖剥夺诱导的p38MAPK活化是不可或缺的；外源性谷氨酸在GFAT1缺陷细胞中的有限作用表明，GFAT1发挥了独立于代谢活性的额外调节作用。
图1. GFAT1激活p38MAPK，通过其酶活性促进细胞存活和肿瘤发生
GFAT1–TAB1相互作用和p38MAPK活化需要TAB1 S438磷酸化
进一步探索GFAT1调节p38MAPK活化的具体机制。Flag-GFAT1在A549细胞中稳定表达，因此进行Flag-GFAT1免疫沉淀后的质谱分析。如图2a，TAB1与葡萄糖缺乏条件下的GFAT1特异性相关。与TAB1在p38MAPK激活中的重要作用一致，葡萄糖剥夺诱导的p38MAPK激活被TAB1耗竭极大地抑制。
在A549和H1299细胞中通过内源性水平的免疫共沉淀进一步验证了GFAT1-TAB1相互作用，其中CIP处理消除了相互作用（图2b），提示蛋白磷酸化参与其中。GST-pull down分析显示，纯化的重组GST-GFAT1成功地与缺糖条件下A549细胞提取物的TAB1结合（图2c，左图）。相反，无论葡萄糖剥夺如何，His-TAB1与细胞GFAT1均未表现出相互作用（图2c，右图）。这些数据表明，葡萄糖剥夺诱导的GFAT1–TAB1相互作用更可能依赖于TAB1中发生的修饰。
为了确定相互作用所需的关键上游信号，使用了AMPK（化合物C）、p38（SB203580）和JNK（SP600125）的抑制剂。免疫共沉淀分析显示，SB203580或SP600125均表现出对GFAT1–TAB1相互作用的中度抑制作用，而当SB203580和SP600125同时使用时，GFAT1–TAB1复合物形成被大量阻断（图2d），揭示p38MAPK与JNK之间存在协同效应。
有趣的是，诱变分析显示，在葡萄糖缺乏的情况下，Ser438（而不是Ser423或Thr431）突变为丙氨酸极大地消除了GFAT1-TAB1相互作用（图2e）。与此结果一致，蛋白激酶检测显示，无论是活性p38α还是JNK1（图2f）可以磷酸化纯化的重组WT TAB1而不是TAB1-S438A，通过特异性TAB1 S438磷酸化抗体验证。而且，GST-pull down分析表明p38α或JNK1与重组纯化的WT TAB1而不是TAB1-S438A孵育成功促进了TAB1的GFAT1结合能力（图2 g，h）。为了进一步检测TAB1 S438磷酸化对p38MAPK活化的影响，用shRNA抗性-WT TAB1（WT rTAB1）或TAB1-S438A（rTAB1-S438A）重建TAB1耗竭的A549和H1299细胞。结果rTAB1-S438A表达的细胞在葡萄糖缺乏下p38MAPK磷酸化在晚期时间点明显下降（图2i），但不在谷氨酰胺缺乏下。这些结果表明，GFAT1–TAB1相互作用所需的TAB1 S438磷酸化对于葡萄糖缺乏下持续的p38MAPK激活是至关重要的。
图2. TAB1以Ser438磷酸化依赖性方式与GFAT1相互作用
GFAT1促进p38MAPK活化所需的TTLL5介导的TAB1谷氨酸化
已知TAB1和p38αMAPK之间的复合物形成可导致p38αMAPK自身磷酸化和活化。A549中的免疫共沉淀分析和H1299细胞表明葡萄糖剥夺明显增加p38αMAPK与WT TAB1的结合，但不增加TAB1-S438A的结合，表明TAB1 S438磷酸化依赖的GFAT1-TAB1相互作用与p38αMAPK募集到TAB1呈正相关。然而，His-pull-down实验显示，JNK介导的TAB1磷酸化在体外并没有显著影响TAB1-p38α相互作用，尽管在JNK存在的情况下，WT TAB1代替 TAB1S438A与GFAT1的结合增强。
Flag-GFAT1沉淀物的质谱分析也揭示了TTLL5，在葡萄糖缺乏的情况下，TTLL5与GFAT1的结合增加，通过免疫沉淀验证。
TTLL5属于一个具有TTL同源结构域的保守蛋白家族，催化谷氨酸与底物连接，调节蛋白相互作用靶蛋白。进一步分析显示，葡萄糖剥夺诱导的内源性GFAT1-TTLL5和TAB1-TTLL5关联。在TAB1耗竭下GFAT1-TTLL5相互作用不受影响，而GFAT1缺失可消除TAB1和TTLL5之间的结合。一致地，在WT rTAB1和rTAB1-S438A表达细胞中，葡萄糖剥夺诱导了相当数量的GFAT1-TTLL5复合物。这些数据表明，GFAT1在TAB1–GFAT1–TTLL5复合物形成中发挥核心作用。
基于上述观察结果，葡萄糖剥夺以TTLL5依赖的方式诱导TAB1谷氨酸化大量增加，通过 GT335检测，一种抗体检测谷氨酸化。同时，发现葡萄糖剥夺诱导的TAB1谷氨酸化被GFAT1缺失阻断，TAB1-S438A而不是WT TAB1未能发生谷氨酸化。为了研究体外TTLL5介导的GFAT1依赖性TAB1谷氨酸化，对WT rTAB1、rTAB1-S438A-和rTAB1-S438D表达细胞的免疫沉淀物（抗HA）进行了体外谷氨酸化酶试验。因此，与WT rTAB1相比，基础条件下rTAB1-S438D（而非rTAB1-S438A）与GFAT1和TTLL5的结合增强。此外，葡萄糖剥夺下WT rTAB1和rTAB1-S438D上谷氨酸化水平升高进一步表明TAB1谷氨酸化依赖于 TAB1/GFAT1/TTLL5复合物形成。相反，谷氨酰胺剥夺既不改变TAB1-p38α相互作用，也不改变TAB1谷氨酸化。再者，葡萄糖剥夺诱导的TAB1谷氨酸化和TAB1-p38α相互作用不受同时谷氨酰胺剥夺8 h的影响。
为绘制TAB1的谷氨酸化位点图谱，进行了诱变分析，结果显示TAB1 E212的突变代替了其他2个表面定位的残基E269或E356进入丙氨酸可显著降低TAB1谷氨酸化以及TAB1的p38αMAPK结合能力，但对TAB1 S438磷酸化无影响。鉴于此，TAB1缺失的A549和H1299细胞用shRNA抗性-TAB1-E212A（rTAB1-E212A）以及WT rTAB1重建。与其对TAB1-p38αMAPK复合物形成的影响一致，rTAB1-E212A表达导致葡萄糖缺乏时p38MAPK磷酸化趋势减弱，但不在谷氨酰胺缺乏下。时程分析显示，在葡萄糖饥饿条件下，TAB1 S438磷酸化的显著增加早于TAB1谷氨酸化出现。虽然TAB1-E212A表达可以显著损害葡萄糖缺乏时p38磷酸化增加在后期时间点仅轻度减弱TAB1 S438磷酸化。因此，可以假定谷氨酸化消除对TAB1 S438磷酸化的有限影响可能是由于谷氨酸化的晚期发生和JNK对p38在TAB1 S438磷酸化中的互补作用。
此外，TAB1磷酸化模拟突变体TAB1-S438D的表达表现出组成性促进其与GFAT1的结合及其谷氨酸化在葡萄糖饥饿条件下未进一步增加p38磷酸化。值得注意的是，TAB1S438D不能在基础水平激活p38进一步揭示了仅发生在葡萄糖饥饿下的TTLL5-TAB1复合物形成也将重要参与GFAT1对p38活性的调节。与TAB1-S438D相比，双突变体 TAB1-E212A/S438D的表达在葡萄糖饥饿条件下很大程度上阻断了细胞p38活化。这些结果表明，GFAT1促进TTLL5介导的TAB1谷氨酸化，随后促进p38MAPK磷酸化。
TAB1 谷氨酸化需要 GFAT1 对谷氨酸盐生成的代谢活性
谷氨酸化修饰的特征是其需要谷氨酸，进一步研究谷氨酸生成的GFAT1活性是否有助于TTLL5介导的TAB1谷氨酸化。结果显示，rGFAT1-H577A表达明显损害了葡萄糖剥夺诱导的TAB1 谷氨酸化或TAB1–p38αMAPK相互作用，但TAB1 S438磷酸化未受影响。
免疫共沉淀分析也表明，在葡萄糖缺乏的情况下，GFAT1-H577A能够与类似于WT GFAT1的TTLL5结合。此外，处理高剂量的外源性谷氨酸而不是GlcN可显著挽救rGFAT1-H577A表达细胞中TAB1谷氨酸化和TAB1-p38αMAPK复合物形成，但在GFAT1缺失的细胞中没有发现。这些结果与GFAT1-H577A的抑制作用和外源性谷氨酸对p38αMAPK磷酸化的补救作用一致。同时，发现外源性谷氨酸对TAB1谷氨酸化和TAB1-p38α相互作用的影响被用于增强胞质羧肽酶活性的CoCl2处理有效阻断，可以对抗TTLL5介导的谷氨酸化。
加上在GFAT1缺失细胞中观察到的外源性谷氨酸盐的有限作用，这些数据进一步表明，GFAT1促进TTLL5抗TAB1活性的物理效应对于TAB1谷氨酸化不可或缺。与这一观点一致的是，加入外源性谷氨酸不能挽救TAB1S438A-或TAB1-E212A-中断的TAB1-p38α相互作用、TAB1谷氨酸化和p38激活。
这些结果表明，葡萄糖缺乏下TAB1谷氨酸化需要GFAT1对谷氨酸生成的代谢活性和GFAT1–TAB1相互作用。
GFAT1/TAB1依赖的p38活化通过自噬促进葡萄糖剥夺下癌细胞存活
葡萄糖剥夺可以刺激自噬，通过自噬细胞可能暂时回收细胞质物质以克服营养应激。已知p38活化参与应激诱导的自噬。
进一步研究自噬是否作为GFAT1-TAB1-p38轴的下游反应调节影响细胞存活。在葡萄糖剥夺下，BIRB796或氯喹（一种用于限制自噬体和溶酶体融合的抑制剂）的处理均可显著抑制自噬，表现为LC3II积累受损或p62降解，伴随着细胞生长受损。相比之下，同时处理氯喹和BIR796并没有表现出对自噬和细胞生长的显著成瘾作用，揭示了在葡萄糖饥饿下p38激活促进肺腺癌细胞存活，这与自噬密切相关。
此外，与WT rGFAT1相比，rGFAT1-H577A的表达明显减弱了葡萄糖剥夺诱导的LC3II积累，氯喹处理在一定程度上挽救了减弱的LC3II。同时，发现加入外源性谷氨酸代替GlcN可明显恢复rGFAT1H577A表达下LC3II积累减弱。值得注意的是，在GFAT1功能完整的细胞中，TAB1耗竭减弱了葡萄糖剥夺诱导的自噬，并阻断外源性谷氨酸对rGFAT1-H577A表达细胞自噬的挽救作用。提示自噬启动需要GFAT1催化的谷氨酸生成。在功能上，与葡萄糖缺乏下的WT组相比，rGFAT1H577A的表达导致细胞活力下降，外源性谷氨酸以TAB1依赖的方式声音挽救了细胞活力。同时，外源性谷氨酸增强的rGFAT1-H577A表达细胞活力也受到氯喹处理的阻碍，进一步表明补充谷氨酸通过其对自噬的积极作用支持细胞活力。此外，发现在葡萄糖缺乏的情况下，与WT对应体相比，rTAB1-S438A，以及rTAB1-E212A的表达戏剧性地抑制了自噬和细胞活力，并且这种效应不能被加入外源性谷氨酸显著挽救。
为了了解外源性谷氨酸对表达rGFAT1-H577A和表达rTAB1-S438A或rTAB1-E212A的细胞自噬和细胞生长的明显影响归因于其对p38活化的相关作用。与此假设一致，在葡萄糖缺乏条件下，MKK6E过表达（组成性激活p38）有效促进了rTAB1-S438A或rTAB1E212A表达细胞的自噬和细胞存活，而氯喹处理可抑制MKK6E增强的细胞存活。说明营养压力下GFAT1/TAB1依赖的p38活化促进自噬和细胞生长。此外，研究发现，在葡萄糖剥夺下通过表达TAB1S438A或TAB1-E212A，细胞增殖减弱，伴随着凋亡事件表现为cleaved-caspase3水平增加；发现这些作用被MKK6E过表达所抵消。这些数据支持p38激活（由葡萄糖饥饿下的GFAT1–TAB1复合物介导）对细胞存活的积极作用可能归因于其在细胞凋亡或自噬中的多种生理作用。
TAB1 S438磷酸化促进肿瘤发生，与肺腺癌预后不良有关
为验证GFAT1对致瘤作用中TAB1依赖性p38活化的调节作用的意义，向无胸腺裸鼠注射分别表达WT rTAB1、rTAB1-S438A或rTAB1-E212A的A549细胞。发现JNK/p38介导的磷酸化或TAB1谷氨酸化的破坏都会导致肿瘤生长受到抑制。免疫印迹分析表明，与体外培养的A549细胞中显示的基础水平相比，WT组肿瘤组织中TAB1的磷酸化水平、p-p38水平和自噬通量显著增强。
在表达rTAB1-S438A或rTAB1E212A的细胞来源的肿瘤组织中p38的活化明显减少。提示体内p38活化和肿瘤生长均需要TAB1磷酸化和谷氨酸化。p38MAPK活化与肺腺癌恶性肿瘤呈正相关已有报道。
该机制研究表明，GFAT1连同TAB1 S438磷酸化有助于p38MAPK活化，因此在87例人肺腺癌标本的连续切片中进行IHC分析，以检测GFAT1、p-p38水平和TAB1 S438磷酸化水平的临床相关性。用特异性封闭肽进行IHC分析证实了TAB1 S438磷酸化抗体的特异性。半定量分析显示p-p38水平与TAB1 S438磷酸化水平呈正相关。进一步的临床分析显示GFAT1与TAB1 S438磷酸化或p-p38的Pearson相关系数仅达到中位值，这可能是由于GFAT1,TAB1 pS438或p-p38的表达可独立受葡萄糖可用性以外的其他因素的影响。根据GFAT1或TAB1 S438磷酸化水平评价患者的生存时间。肿瘤显示GFAT1低表达的患者（27例）中位生存时间为60个月；肿瘤显示GFAT1高水平的患者（60例）中位生存时间显著降低，为33个月。同时，肿瘤TAB1 S438磷酸化水平低（30例）的患者中位生存期明显增高；肿瘤TAB1 S438磷酸化水平高（57例）的患者中位生存期为39个月。患者性别和年龄调整的cox-multivariate分析表明GFAT1和TAB1 S438磷酸化的水平与患者生存率显著相关。这些数据表明，GFAT1或TAB1 S438高磷酸化可预测人肺腺癌的不良预后。
Wei S, Zhao Q, Zheng K, et al. GFAT1-linked TAB1 glutamylation sustains p38 MAPK activation and promotes lung cancer cell survival under glucose starvation. Cell Discovery (2022) 8:77 https://doi.org/10.1038/s41421-022-00423-0.
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