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MET 外显子 14 跳跃突变检测的现实困境与优化策略 —— 基于真实世界队列及多国室间质评数据解析

09月24日

整理：肿瘤资讯

来源：肿瘤资讯

MET 外显子 14 跳跃突变是非小细胞肺癌重要的驱动变异，在肺腺癌人群中发生率约 3%-4%。伴随多款 MET 靶向抑制剂在全球获批，精准识别该类变异已经成为指导晚期非小细胞肺癌靶向用药的关键前提。但该类变异可发生在剪接供体、剪接受体、多聚嘧啶束等多个区域，变异类型繁杂多样，已报道的致病变异超百种，给临床分子检测带来不小挑战。DNA-NGS 与 RNA-NGS 两种主流检测技术各有利弊，如何合理选择、组合检测方案，是目前病理与临床亟待厘清的现实问题。依托一项大规模真实世界样本队列以及全球首次多国 MET 外显子 14 跳跃突变外部质量评价项目数据，可以帮助我们认清检测过程中的各类技术陷阱，为规范化检测提供参考依据。

该研究由两大部分构成，一是回顾性真实世界队列，纳入 2016-2024 年 379 例经常规病理初判存在 MET 外显子 14 及其剪接区域变异的非小细胞肺癌 FFPE 组织标本，同步开展 DNA-NGS 与 RNA-NGS 配对检测，对 DNA 层面检出的各类变异，借助 RNA 测序验证其是否真正产生外显子 14 跳跃的转录本改变。第二部分为跨国室间质评项目，分别针对 FFPE 组织样本和液体活检样本开展两轮检测能力评估，以此反映全球不同实验室的实际检测水平。DNA 测序包含扩增子、杂交捕获两种主流技术平台，RNA 测序则采用融合基因专用检测体系完成分析。

MET 外显子 14 区域变异具有高度异质性

在 379 例阳性初筛样本中，一共识别出 171 种截然不同的变异形式。变异位点分布广泛，多聚嘧啶束、剪接受体位点、14 号外显子本体、剪接供体位点均会出现突变；其中有 140 种属于插入或者缺失变异，片段长短跨度很大，最短仅数个碱基，最长可达 63 个碱基。如此丰富多变的变异谱，对 NGS 检测 Panel 的探针设计、区域覆盖完整性提出很高要求，一旦部分剪接相关内含子区域覆盖不足，就容易造成漏检。

DNA-NGS 与 RNA-NGS 配对对比，暴露多重技术短板

对同时完成两种检测的 114 种 DNA 变异进行 RNA 水平验证，其中 107 种可以确认真实发生 MET 外显子 14 跳跃，剩余 7 种 DNA 检出的变异并未造成转录层面剪接异常，属于无功能改变。这一结果提示仅依靠 DNA 测序结果，会出现假阳性误判。

研究总结出三类典型检测问题。第一，部分功能性变异会被 DNA-NGS 遗漏。部分大片段缺失变异，以及位于剪接位点的同义突变，尽管氨基酸序列没有发生改变，但可以干扰 RNA 剪接过程，最终造成外显子 14 跳跃。这类变异常常被 DNA 测序的生物信息过滤流程直接剔除，只有 RNA-NGS 可以直接捕捉到异常转录本，实现阳性检出。

第二，DNA 检出不等于功能致病。有 7 种错义变异在 DNA 测序中报告阳性，但 RNA 层面并未观察到外显子跳跃。这意味着，仅仅在 DNA 上找到发生于 14 号外显子周边的突变，不能直接等同于具备临床用药意义的 MET 外显子 14 跳跃突变，必须评估变异对 RNA 剪接的实际影响。

第三，RNA-NGS 本身也存在样本限制。队列中有 57 个样本，因为 FFPE 标本 RNA 降解、RNA 得率不足，无法完成 RNA 测序验证。其中既包含已经被文献证实的明确致病突变，也包含大量剪接区插入缺失和意义不明变异。这反映出临床存档石蜡标本中，RNA 质量不足是 RNA 测序广泛落地的现实阻碍。

多国室间质评反映组织与液体活检的检测差距

两轮跨国室间质评结果显示，FFPE 组织标本整体检测表现稳定，2024 年参与评估的 50 家机构中，49 家顺利通过考核，实验室采用的技术方案组合多样，包含 DNA-NGS、RNA-NGS、RT-qPCR、Sanger 测序等不同手段。与之相比，液体活检 ctDNA 检测的整体能力尚有较大提升空间。2022 年液体活检参评机构合格率仅 37.5%；经过两年技术迭代，2024 年合格率提升至 63%，但仍有接近四成实验室无法得到正确结果。

对液体活检假阴性案例溯源后发现两大核心诱因。其一为测序覆盖深度不足，对于等位基因频率较低的变异，如果测序深度不够，很容易发生漏检；其二是生物信息分析参数设置过于严苛，即便测序深度充足，低丰度变异也会被软件过滤筛除，最终报告阴性结果。

对临床检测实践的启示

结合真实队列与室间质评结果，MET 外显子 14 跳跃突变的规范化检测可以得到几点明确启示。首先，优先提倡 DNA-NGS 联合 RNA-NGS 互补检测。RNA 测序可以直接观察转录本剪接产物，一方面排除 DNA 测序检出的无功能变异，规避假阳性报告，指导靶向药物合理使用；另一方面能够检出 DNA 平台容易漏掉的大片段缺失、剪接区同义突变。但当石蜡样本 RNA 质量差、无法开展 RNA 测序时，需要结合变异位置、已发表数据库、剪接预测工具谨慎解读 DNA 测序结果。

其次，需要优化 DNA 测序配套的生物信息分析流程。剪接位点同义变异虽然不改变蛋白序列，但仍可能破坏剪接信号。不能依靠软件默认参数直接过滤同义突变，应当保留对内含子-外显子交界区域各类变异的人工复核环节，减少假阴性。

最后，液体活检 ctDNA 用于 MET 外显子 14 跳跃突变检测存在固有局限。临床应用时需要保证足够测序深度，合理设置变异过滤阈值，同时做好方法学验证。对于液体活检阴性，但临床高度怀疑驱动变异的患者，应当尽可能争取组织标本检测，避免因假阴性错失靶向治疗机会。

总而言之，MET 外显子 14 跳跃突变检测不能简单依赖单一测序平台。临床分子报告不能只罗列 DNA 层面的基因改变，还需要结合变异的剪接功能效应进行综合判读。持续推进检测室间质控、完善平台与生信流程，才能更好服务于非小细胞肺癌 MET 靶向治疗的精准诊疗。

责任编辑：肿瘤资讯-Skylar
排版编辑：肿瘤资讯-章修愚

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