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瑞派替尼作为晚期胃肠间质瘤（GIST）的四线标准治疗药物已被临床广泛应用，但其耐药机制尚不明确。值得庆幸的是，南京医科大学第一附属医院徐皓教授团队于2024年7月在期刊《Advanced Science》（IF=14.3）上发表题为“USP5 Promotes Ripretinib Resistance in Gastrointestinal Stromal Tumors by MDH2 Deubiquition”的研究论文，首次揭示了泛素化在瑞派替尼治疗GIST耐药过程中发挥的重要作用，其具体机制与USP5-MDH2轴有关，这与既往报道的野生型GIST的耐药机制类似。因此，对于瑞派替尼耐药的临床策略或可参考野生型GIST的治疗策略。【肿瘤资讯】特邀徐皓教授对该研究进行深入解读，详细剖析瑞派替尼治疗GIST的耐药机制，以期为后续临床治疗策略的制定提供一定的参考依据。
南京医科大学第一附属医院普外科副主任
中国抗癌协会胃癌专业委员会委员
中国抗癌学会手术与质量控制专业委员会委员
中国研究型医院学会消化道肿瘤专业委员会委员
中国医师协会外科医师分会胃肠道间质瘤诊疗专家工作组委员
中国抗癌协会胃肠道间质瘤专业委员会委员
中国临床肿瘤学会（CSCO）胃肠间质瘤专家委员会委员
中国研究型医院学会上消化道肿瘤专业委员会委员
江苏省医学会外科学分会委员
江苏省医学会外科学分会外科营养学组副组长
江苏省抗癌协会理事
江苏省抗癌协会胃癌专业委员会委员
徐皓教授专访视频
瑞派替尼广泛应用，耐药问题亟待解决
徐皓教授：瑞派替尼是一种新型的开关控制酪氨酸激酶抑制剂（TKI），能广泛抑制KIT或PDGFRA基因的多种原发和继发突变，在国内外各项临床研究中均显现出显著的临床活性和良好的安全性特征。特别是在中国人群中体现出更佳的临床疗效：四线治疗的mPFS为6.4个月，二线治疗的疗效🔍略优于舒尼替尼（mPFS 10.3 vs 8.3个月）。目前，NCCN🔍和CSCO指南🔍均推荐瑞派替尼作为晚期GIST的二线和四线治疗选择。随着瑞派替尼广泛的临床应用，耐药事件也随之发生，但其耐药机制尚不明确，瑞派替尼耐药后的治疗方案选择仍旧困扰着临床。因此，探索瑞派替尼的耐药机制成为了亟待解决的临床问题之一。
泛素化是蛋白翻译后修饰的方式之一，其可参与蛋白质的降解，在调节肿瘤细胞功能方面发挥着重要作用。USP5是一种去泛素化酶，其通过靶向不同的蛋白而在包括乳腺癌和肝癌在内的多种肿瘤中发挥作用。而USP5和GIST耐药之间的相关性尚未见报道。
研究方法
本研究共筛选了28例患者的GIST组织样本，所有患者均为非KIT继发性突变患者，其中包括14例瑞派替尼（RP）敏感（RP-S）和14例瑞派替尼耐药（RP-R），用药前后其基因型无变化，所有样本均来自南京医科大学第一附属医院。敏感组患者的组织样本在术中采集，而耐药组患者的样本在手术或CT引导活检期间采集。
主要研究结果
USP5可促进RP耐药和GIST的恶性增殖
蛋白质组学分析比较3例RP耐药和3例RP敏感GIST组织中蛋白表达和泛素化的变化：耐药组织中共发现295个上调蛋白和99个下调蛋白，以及20个蛋白泛素化增加和57个蛋白泛素化减少，对不同表达的蛋白和表现出泛素化改变的蛋白进行重叠分析发现8种不同的蛋白，其中USP5的p值小于0.01，作为进一步研究的靶蛋白。结果显示，USP5的表达水平与RP耐药性增强直接相关（图1）。
图1. A）RP-R和RP-S患者中不同表达蛋白和泛素修饰位点的热图；B）RP-R和RP-S患者中差异表达蛋白和泛素修饰位点的维恩图；C）USP5的免疫组化图；D,E）RP-R和RP-S组织中USP5的蛋白表达水平；F）USP5表达的无进展生存期Kaplan-Meier图。
TRIM21调节USP5的泛素化，可降低USP5表达，并在控制USP5稳定性中发挥调节作用
经过蛋白合成抑制剂CHX抑制细胞蛋白质合成后，USP5随时间逐渐降解；蛋白酶体抑制剂MG132处理后USP5蛋白水平增加，因此USP5的调节效应可能发生在翻译后水平，通过泛素-蛋白酶体系统。质谱（MS）和免疫沉淀（IP）分析鉴定了与USP5相互作用的蛋白—泛素化酶TRIM21，其在调节USP5稳定性中起关键作用（图2）。
图2. A,B) USP5的蛋白水平；C）通过质谱分析鉴别的 USP5 结合蛋白的基峰；D）共聚焦图像显示 GIST-RPR 细胞中USP5（红色）和TRIM21（绿色）共定位；E,F）用抗 TRIM21 和 USP5 的抗体对 GIST-RPR 细胞的细胞裂解物的 IP 和免疫印记分析；G) HEK293T细胞用 His-USP5 单独或与 Flag 标记的野生型 TRIM21 或 TRIM21CA 联合转染后的免疫印迹分析；H）GIST细胞中 TRIM21 的蛋白水平。
USP5调节MDH2的去泛素化，增加MDH2的蛋白稳定性，MDH2可诱导RP耐药
对敏感细胞和耐药细胞差异表达蛋白进行了功能富集分析，并与USP5的质谱数据相结合，鉴定出了MDH2。RP-R细胞中MDH2蛋白高表达，而MDH2 mRNA表达无明显差异。经CHX和MG132处理后，MDH2蛋白水平随之而变化，因此MDH2可能通过泛素-蛋白酶体系统翻译后调节。通过IP和免疫印记法证实USP5通过其去泛素化酶活性调节MDH2，增加MDH2的蛋白稳定性。过表达MDH2可有效增加RP敏感细胞的IC50，同时可催化α-酮戊二酸（α-KG）生成肿瘤代谢产物2-羟基戊二酸（2-HG），从而诱导RP耐药（图3）。
图3. A）GO富集分析中确定的RP-R和RP-S患者中差异表达蛋白的生物学过程；B）GIST细胞中MDH2的蛋白水平；C）GIST细胞中MDH2靶基因的RT-qPCR分析；D,E）经CHX或MG132处理后的细胞中MDH2蛋白水平; F）野生型USP5或突变体转染HEK293T细胞的MDH2蛋白水平; G,H）转染USP5 shRNA的RPR细胞的MDH2蛋白水平；J,K）MDH2过表达与沉默的GIST细胞活性分析
ZDHHC18棕榈酰化MDH2从而抑制MDH2泛素化
棕榈酰化可能通过影响蛋白泛素化影响下游蛋白降解，本研究中观察到，在CHX处理的RPR细胞中，逐渐加入棕榈酰化抑制剂2-BP促进MDH2降解，ZDHHC18敲除后USP5对MDH2的去泛素化作用减弱。因此，USP5-ZDHHC18-MDH2轴在驱动GIST细胞恶性增殖和RP耐药中发挥关键作用（图4）。
图4. A）MDH2蛋白表达；B）棕榈酰化抑制剂2-BP处理GIST-RPR细胞后的MDH2蛋白水平；C,D,E）MDH2的去泛素化
阐明瑞派替尼耐药机制，以期指导临床实践
徐皓教授：该研究通过泛素组学和蛋白组学联合分析，揭示泛素化在胃肠间质瘤瑞派替尼耐药中发挥重要作用，其具体机制与USP5-MDH2轴有关。瑞派替尼耐药的GIST细胞中USP5蛋白水平明显升高，而泛素化水平降低，并结合质谱分析结果验证了TRIM21通过泛素化调节USP5的表达，USP5通过去泛素化调节下游MDH2表达，进而抑制其蛋白降解。此外，ZDHHC18可以使MDH2棕榈酰化，降低其泛素化水平，进一步提高蛋白质稳定性。在耐药细胞下游堆积的MDH2促进α-KG转化为2-HG，从而影响α-KG依赖加双氧酶及下游酶的反应，最终促进了肿瘤细胞对瑞派替尼的耐药性。本研究强调了泛素化与耐药性之间的相关性，提示靶向USP5-MDH2轴可抵制瑞派替尼对GIST的耐药性。
图5 该研究的机制图
瑞派替尼这一耐药机制与既往报道的野生型GIST，尤其是SDH缺陷型GIST的耐药机制类似。因此对于瑞派替尼耐药的临床策略或可参考野生型GIST的治疗策略。未来或许可尝试瑞派替尼联合MDH2抑制剂或联合对野生型GIST有效的药物，例如替莫唑胺、舒尼替尼等抗血管生成抑制剂或者奥雷巴替尼等。目前瑞派替尼耐药后的治疗以加量治疗或联合其它TKI🔍为主，我们希望通过加强基础与临床研究为标准治疗进展的患者寻找到更佳合适的治疗方案，更大程度地延长生存。
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