免疫检查点抑制剂，尤其是针对PD-(L)1的抗体，因其显著的长期疗效，已成为晚期非小细胞肺癌（NSCLC）治疗的新标准。尽管如此，超过半数的初始响应患者最终会因获得性耐药（AR）而疾病复发，这一现象相较于原发性耐药更具挑战性，但目前对AR的分子机制了解有限，且缺乏有效的治疗策略。
近期，国际知名医学期刊Cancer Cell上发表的一篇题为“Clinical and molecular features of acquired resistance to immunotherapy in non-small cell lung cancer” 的研究。该研究由来自欧洲分子生物学实验室（EMBL）、剑桥大学癌症研究所、纪念斯隆凯特琳癌症中心（MSK）、宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院等不同机构的多位跨学科领域专家共同完成，研究旨在深入探索AR机制并寻找克服之道。研究结果提示，持续且上调的干扰素（IFN）信号与发生获得性耐药之间存在相关性。这些发现或可为克服NSCLC患者的AR提供重要的参考和启示。
分子机制的探索
既往研究发现，缺乏关键的抗原递呈（AP）相关蛋白的缺失或干扰素-γ（IFNγ）信号通路的异常可导致免疫治疗耐药性的发生。进一步的临床前研究强调了IFNγ的相对急性和长期暴露如何影响免疫功能失调和肿瘤的耐药性。因此，深入了解获得性耐药耐药患者临床特征和肿瘤的遗传学和生物学机制，对未来制定更有效的下一代免疫治疗策略的至关重要。
图1 研究概述
获得性耐药的普遍性
该项研究纳入了美国纪念斯隆凯特琳癌症中心（MSKCC）自2011年4月至2017年12月间收治并接受抑制PD-1抑制剂治疗的NSCLC患者，共计1201例。其中243例（20%）初次治疗即产生应答反应。然而，随访至第5年时，预估的获得性耐药发生率为61% (95% CI：36%-85%)。此外，NSCLC患者获得性耐药的起始时间有差异。总体而言，52% 的患者在1年内发展出获得性耐药, 而1-2年和2年以上的发生率则分别为39%和11%。患者发生获得性耐药的相对风险随着初始应答持续时间的延长而降低。
为了阐明NSCLC患者免疫治疗获得性耐药的分子机制, 研究者进行了基于微阵列的全转录组表达数据分析，并对部分获得性耐药患者治疗前后的肿瘤样本进行了全外显子组测序 (WES)。这些患者的基本特征与更大临床队列相似。研究表明，获得性耐药通常表现为寡进展。这突显了评估病灶水平反应在获得性耐药分析中的重要性。
为进一步深入了解PD-1抑制剂治疗引起的获得性耐药及其特征性转录图谱。研究者对42个样本的全转录组数据进行蛋白编码基因表达谱主成分分析（PCA）和单样本基因组富集分析（ssGSEA），并发现在治疗前后时间点上，配对的样本呈现出分离的趋势，这主要是由与免疫相关的标志性基因集驱动(图1A-B)。配对样本标志基因集的差异表达分析表明，治疗后不仅 IFN α/γ应答、氧化磷酸化和 DNA 修复通路显著上调 (图2C)，而且免疫浸润，特别是 CD8+ T 细胞显著增加 (图2D-F)。通过比较临床和临床前研究积累的批量或单细胞RNA-seq数据集，研究者整理了与免疫检查点抑制剂（ICB）耐药和T细胞功能障碍相关的基因集，并发现在配对样本之间存在差异变化，包括AP通路、IFNγ、CD8 T效应细胞和增殖性耗竭的CD8+ T细胞的表达增加，而WNT通路的基因表达则略有下降。PD-1抑制剂治疗后肿瘤中表达增强的基因包括GZMA、B2M和CXCL9，这与免疫治疗引起的持续免疫反应相关的基因集一致。
图2 耐药病变表现为 IFNγ 应答通路上调和 CD8+ T 细胞浸润
IFNγ应答通路的长期和治疗依赖性增加是免疫检查点抑制剂获得性耐药的潜在途径
考虑到患者队列中疾病进展时间的多样性，研究者采用Phenopath进行了拟时间分析，模拟了基于患者队列内基因表达差异的连续疾病进展。结果显示，在治疗前后样本中，基因表达的差异性较大，拟时间评分通常在治疗后表现为增长趋势，尤其是对于治疗前拟时间估值较低的患者。进一步的分析表明，在与拟时间呈正相关的前10个通路中，多个I型和II型的IFN（IIFN γ）应答相关基因或干扰素刺激基因（ISGs）表达差异变化显著，并以此将获得性耐药患者分为两组：IFN γ应答“稳定”组和IFN γ应答“增加”组（即治疗期间和治疗后相关基因表达上调）。此外，研究者还发现临床队列中观察到IFNγ应答基因的特征存在与黑色素瘤模型小鼠对免疫治疗耐药与治疗诱导的IFNγ应答改变显著相关。除表现为CD8+ T细胞耗竭的特征外，研究中还观察到调节性T细胞的增加。此外，在 IFN γ相关基因“增加”的亚组样本中，FOXP3特异性上调。相较之下，IFN γ相关基因“稳定”表达的患者中这些免疫相关通路和基因无变化。这些数据共同表明，在NSCLC患者中，对PD-1抑制剂治疗产生的反复获得性耐药与肿瘤中IFN γ转录程序的激活、肿瘤特异性IFN γ信号的改变，以及随之而来的微环境中CD8+ T细胞耗竭增加密切相关（图3）。
图3 获得性耐药患者的部分样本在治疗后出现IFNγ应答上调和T细胞耗竭特征性表现
获得性耐药相关的抗原呈递基因突变的正向选择压力
随后，为探索获得性耐药的体细胞改变和潜在机制，研究者随即评估了12例患者治疗前后的外显子组测序数据。后发现有 7 例患者肿瘤样本中的克隆或亚克隆结构发生了重塑。其中5例患者样本治疗后保留了克隆突变，但丢失和/或获得了新的亚克隆突变（图 4B）。另2例患者在治疗后未发生任何突变，这可能提示出现新肿瘤或是一种罕见的（即低于 WES 检测极限的）原有肿瘤克隆的生长。
与 IFN γ 应答 "稳定 "组的患者样本相比，IFN γ应答 "增加 "的病例样本中 AP 通路的突变增加更为常见。值得注意的是，在克隆或亚克隆结构发生显著变化的4例患者肿瘤细胞中，B2M 和 1 类 HLA 蛋白表达检测结果均为阴性或较基线有所下降 (图4F和G)；且有3例样本在治疗后也出现了 AP 通路基因的新突变（图 4E）。
图4 肺癌PD-1抑制剂获得性耐药的基因组动力学
获得性耐药与ISGs升高和肿瘤IFN γ信号改变有关
在了解获得性耐药的体细胞改变和潜在机制后，为了更深入地了解临床研究队列中获得性耐性与免疫检查点抑制剂间的转录特征，研究者在具有高肿瘤负荷突变、对免疫治疗高度敏感的CT26小鼠上重建PD-1抑制剂治疗后获得性耐药模型，以评估IFNγ应答对获得性耐药的影响。为此，研究者从抗 PD-1 治疗后CT26小鼠模型中切除肿瘤，获取依旧存活的细胞经体外培养后多次重新移植到小鼠体内，直至肿瘤对抗 PD-1 抗体治疗不再产生应答反应。相对于亲代敏感细胞，在第4轮处理时获得的耐药细胞系已表现出显著升高的IFNγ应答相关基因和ISGs基线表达，以及IFN 相关转录因子 如STAT1 和 IRF1 活性的增加。这些发现与此前研究者认为ISGs升高和表观遗传学变化有关的看法相一致。ATAC测序显示，相较于亲代细胞或对照组的体内传代细胞，第4代抗PD-1耐药细胞中JAK-STAT通路和IRF1结合位点显著富集。
为了验证这些发现，研究者在另一种相对更为成熟的免疫原性肿瘤模型---MC38 大肠癌肿瘤中再次重复了该试验（图5）。综合而言，研究结果进一步证实了IFN相关转录因子活性的增强可能是耐药癌细胞ISG基线表达升高的原因之一。
图5 获得性耐药CT26小鼠肿瘤细胞内IFNγ信号传导功能失调
长期IFNγ刺激可引发肺癌细胞ISGs升高、耐药和免疫功能紊乱
研究者采用了两种同系小鼠肺癌模型：Kraslox-stop-lox(lsl)-G12D/+；Trp53flox/flox (KP) 基因工程小鼠模型和 Lewis 肺癌 (LLC1)，以验证长期IFN 刺激是否会使NSCLC对 ICB 产生治疗抵抗并导致 T 细胞功能障碍。结果显示，来自长期IFN γ暴露的细胞（γKP 和 γLLC1）的肿瘤对免疫检查点抑制剂（ ICB ）表现出更强的耐药性，而且IFN γ相关 ISGs 的表达也有提高。这与未经处理的肿瘤中分选出的癌细胞（ResKP2、ResResKP、ResKPlate 和 ResResLLC1）的表现相似。此外，与长期 IFN 信号相关的肿瘤，无论是通过长期 IFN γ刺激（γLLC1）或晚期复发来源的细胞系（ResResLLC1），对双重 ICB（抗 PD-1 + 抗 CTLA-4 的组合）的应答减弱。这些临床前数据支持了之前的发现，即ICB 治疗后ISGs 的升高与肿瘤进展具有关联性。在携带长期 IFN 信号的 LLC1 模型（gLLC1）或晚期复发来源的 LLC1 肿瘤细胞系（ResResLLC1）中，可观察到ICB 疗效减弱，其特征是功能失调的 PD-1+TIM-3+ 衰竭 T 细胞的积累。不仅如此，研究者还对 LLC1 肿瘤中的免疫浸润进行了系统鉴定。结果显示，长期IFN刺激或晚期复发的肿瘤样本中，T 细胞衰竭标记物（PD-1+、TIM-3+ 等）占主导地位的元簇在ICB治疗后出现的频率增加，而初始敏感肿瘤样本则无（图6）。
图6 在LLC1同系肺癌小鼠模型中，ICB获得性耐药与被诱导耗竭的CD8+ T细胞相关
总结与展望：克服耐药新策略
虽然PD-(L)1抑制剂免疫治疗是肺癌的常规治疗方法，但人们对获得性耐药性知之甚少。在1201名接受PD-(L)1抑制剂治疗的NSCLC患者中，超过60%的初始应答者后续出现获得性耐药的发生。研究者此前已经证明，长期 IFN γ信号传导可能会引发肿瘤细胞的一连串包括 ISGs 增强在内的表观遗传修饰改变，并最终产生先天性和适应性免疫衰竭和功能障碍的反馈回路。而本项研究则进一步为之前的临床前和转化数据提供了依据，证实了IFN γ在免疫治疗的敏感性和耐药性方面发挥着错综复杂的作用。初始的 IFN γ 暴露可能是 T 细胞活化的基础，也是免疫反应的标志，但长期的IFN γ刺激及其引发的ISGs升高则导致了免疫治疗获得性耐药的发生。未来研究者还需进一步研究，以明确免疫细胞和肿瘤细胞对IFN γ信号传导的具体机制差异。总的来说，该研究发现可为制定更加合理的治疗策略提供指导意见，或将实现预防、克服并逆转肺癌患者对PD-(L)1抑制剂的耐药性。
Memon D, Schoenfeld AJ, Ye D, Fromm G, Rizvi H, Zhang X, Keddar MR, Mathew D, Yoo KJ, Qiu J, Lihm J, Miriyala J, Sauter JL, Luo J, Chow A, Bhanot UK, McCarthy C, Vanderbilt CM, Liu C, Abu-Akeel M, Plodkowski AJ, McGranahan N, Łuksza M, Greenbaum BD, Merghoub T, Achour I, Barrett JC, Stewart R, Beltrao P, Schreiber TH, Minn AJ, Miller ML, Hellmann MD. Clinical and molecular features of acquired resistance to immunotherapy in non-small cell lung cancer. Cancer Cell. 2024 Feb 12;42(2):209-224.e9. doi: 10.1016/j.ccell.2023.12.013. Epub 2024 Jan 11. PMID: 38215748.
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