B细胞淋巴瘤是一组起源于B细胞的具有异质性的血液系统恶性肿瘤，分为侵袭性B细胞淋巴瘤和惰性B细胞淋巴瘤。虽然疾病缓解率很高，但部分患者仍会复发进展，因此治疗后定期监测及早期识别肿瘤复发具有重要意义。当前的诊疗中，淋巴瘤的复发主要依靠影像学和临床评估，而部分研究显示基于流式细胞术或二代测序等手段的微小残留病（MRD）检测可以更加准确评估疾病缓解深度及判断预后，同时早期识别疾病复发。文章围绕MRD监测在惰性淋巴瘤和侵袭性淋巴瘤中的应用现状展开综述，主要包括MRD的检测方法及其在不同淋巴瘤中的研究现状及应用前景。
B细胞淋巴瘤是一组起源于淋巴组织的恶性肿瘤，不同亚型具有不同的治疗方法和预后。目前临床上主要通过影像学及临床评估评价患者疗效，如氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描（FDG-PET）和CT[ 1 , 2 , 3 ]。然而，这些评估方法无法准确评估疗效及早期识别复发患者，且影像学检查的辐射暴露增加继发性恶性肿瘤的风险[ 3 , 4 , 5 ]。淋巴瘤中的微小残留病（MRD）是指残留的肿瘤细胞，无法通过常规形态学方法检测到[ 6 ]。MRD检测的高敏感性可以对肿瘤患者精准评估疗效及早期识别复发。目前基于聚合酶链反应（PCR）和二代测序（NGS）检测MRD的方法稳健发展，为MRD在B细胞淋巴瘤中的研究打开了大门。现就MRD检测方法及其在一些B细胞淋巴瘤亚型中的应用现状进行综述。
1 MRD检测方法
MRD可以使用不同的方法检测，包括分子生物学、流式细胞术以及影像学等。流式细胞术检测MRD是将肿瘤细胞暴露于荧光标记的抗体中，并根据发出的免疫荧光来分类细胞群。采用流式细胞术检测需要依赖特异免疫表型，对于无特异免疫表型的B细胞淋巴瘤不适用。基于6色或8色的流式细胞术灵敏度约为1×10-4~1×10-5，且流式细胞术检测成本更低，可以在短时间内进行检测，因此广泛应用于临床。
采用分子生物学进行MRD检测主要基于PCR或NGS来评估残留肿瘤细胞的分子标志物[ 7 , 8 ]。基于PCR技术检测MRD主要依靠3种靶标：（1）免疫球蛋白重链（IGH）/免疫球蛋白轻链重排；（2）染色体易位；（3）异常基因或异常表达基因[ 9 ]。目前实时定量PCR（RQ-PCR）技术是MRD检测中最成熟、最标准化的方法，且灵敏度较高（1×10-5）[ 6 ]，能够量化残留肿瘤细胞的数量。但RQ-PCR仍然存在缺陷，使用IGH重排检测MRD需要特异性引物，频繁体细胞突变可能会导致引物序列改变从而影响RQ-PCR的灵敏性，但不是所有B细胞淋巴瘤亚型都有特异易位，因此不适用于所有的亚型；且RQ-PCR进行定量时需要连续稀释标准参考曲线进行定量，因此结果可能有误差。数字液滴PCR（ddPCR）是一种高通量PCR，其通过水油乳浊液滴系统将模板DNA分子分割成微滴，用端点PCR的方式实现扩增，然后通过荧光数据采集和泊松统计分析得到结果。ddPCR通常选用突变基因作为检测靶点，如华氏巨球蛋白血症中MYD88L265P突变等。ddPCR与传统的PCR相比灵敏度更高（5×10-5），而且避免了使用标准曲线，提高定量准确性并有更广泛适用性。缺点是对于一部分肿瘤负荷介于ddPCR的灵敏度和定量范围之间的样本无法进行定量，而这部分样本被定义为"阳性不可量化"[ 10 ]；另外ddPCR无法发现未知突变，没有规范的通用标准[ 11 , 12 ]。
NGS又称为高通量测序，能够在一次测试中对数百至数千基因进行测序，具有高通量、高灵敏度（1×10-6），适用性更广泛等优势[ 13 ]。NGS不但能识别IGH重排以及突变基因作为靶标，而且能够检测出未知的突变基因，为靶点检测提供更多可能性。与RQ-PCR进行比较发现RQ-PCR检测为MRD阳性的患者，可被NGS检测为阴性，而检测为阳性不可量化的患者可以更精准地分为不同类别。这说明NGS是一种更准确、应用更广泛的MRD检测方法[ 14 ]。但NGS价格昂贵，对相关人员的技术要求更高，检测时间更长。
此外，液体活组织检查是MRD检测在B细胞淋巴瘤的一个新领域，可以通过循环肿瘤细胞（CTC）或无细胞循环肿瘤DNA（ctDNA）进行MRD监测。ctDNA是指肿瘤细胞DNA经细胞凋亡、死亡或分泌到外周循环血液中的一种特征性的肿瘤生物标志物[ 15 ]。目前临床上常通过有创操作取血液或骨髓进行MRD检测，而液体活组织检查克服这一缺陷，检测样本可以是血液和尿液，采样的非侵袭性操作有效提高患者的依从性，在随访过程中可连续采样[ 16 ]。并且液体活组织检查可以通过NGS识别和追踪复发的体细胞突变，与传统的分子靶向标志相比，液体活组织检查更具有靶向性，更加凸显肿瘤异质性，更利于诊断。然而临床应用ctDNA仍需要克服一些问题，实验步骤需要严格标准化，在数据分析过程中缺乏通用标准，而且目前其临床可行性仍在评估阶段，还需要大量的研究证实。
2 MRD监测在惰性淋巴瘤中的应用现状
2.1 慢性淋巴细胞白血病（CLL）
MRD监测在CLL中的相关研究进行得较早，相关证据多，国际CLL工作组（iWCLL）在指南中提出CLL的疗效评估中应该结合MRD检测[ 17 ]。CLL危险分层体系的完善和治疗方案的改善，MRD监测可以作为CLL的独立预后影响因素。
MRD在CLL中作为独立预后影响因素在德国CLL研究组的3项随机的化学免疫治疗研究中得到证实。CLL8、CLL10和CLL11研究表明，MRD与无进展生存（PFS）时间、总生存（OS）时间相关[ 18 , 19 , 20 ]。在CLL8中，对393例患者进行流式MRD检测，并分为低水平（<1×10-4）、中水平（且≥1×10-4且<1×10-2）和高水平组（≥10-2）3组，在治疗2个月后进行评估，低、中、高水平3组患者的中位PFS时间分别为68.7、40.5、15.4个月，与低水平的MRD患者相比，中、高水平组的患者疾病进展风险更高。高水平组中位OS时间48.4个月，但低、中水平组均未达到[ 18 ]。CLL10中，对337例患者流式细胞术MRD分析，MRD阳性（≥1×10-4）患者的中位PFS时间23.9个月，而MRD阴性的（<1×10-4）的中位PFS时间65.2个月[ 19 ]。在CLL11中，对474例患者进行ASO-PCR检测，MRD阳性患者的中位PFS时间为19.4个月，而MRD阴性患者的中位PFS时间未达到[ 20 ]。对3项临床试验进行汇总分析，无论患者是否达到部分缓解（PR）/完全缓解（CR），在治疗结束时MRD阴性的患者有更好的PFS和OS。证实了MRD可以作为CLL的独立预后因素。而且CLL8/10/11 3项随机试验建立回归模型分析，证实MRD可以作为PFS时间的替代终点[ 21 ]。
靶向治疗是复发难治CLL的治疗选择，布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂（BTKi）单药治疗耐受性良好，且持续用药能延长缓解时间并加深缓解深度[ 22 ]。在一项随机对照试验中，将578例患者随机1∶1分配至苯达莫司+利妥昔单抗（BR）联合伊布替尼或安慰剂（IBR或BR组）治疗，中位治疗时间34.7个月，IBR组MRD阴性比MRD阳性患者36个月PFS率分别为88.6%比60.1%，OS无明显差异，表明MRD状态与PFS有显著相关。BTKi联合bcl-2抑制剂治疗可提高MRD阴性率。在CLARITY试验中，159例初治CLL患者接受伊布替尼（I）联合维奈克拉（V）治疗，在治疗12个周期后通过流式细胞术检测MRD，结果显示77%的患者的外周血（PB）和60%的患者的骨髓（BM）实现了MRD阴性，其中89%的患者CR持续1年甚至更长时间[ 23 ]。随后伊布替尼联合维奈克拉治疗后达到MRD阴性的患者随机分配到安慰剂组和伊布替尼维持组，1年无病生存期（DFS）的发生率为95%比100%（P＝0.15），研究表明伊布替尼联合维奈克拉不但可以提高MRD阴性率，且能延长深度缓解时间；在达到MRD阴性状态下，不仅可停药且停药后第1年早期复发风险较低[ 23 ]。MRD状态不仅与患者生存相关，并且初步可指导CLL患者停药。该结果在相关研究中同样得到证实[ 24 , 25 ]。
2.2 滤泡淋巴瘤（FL）
FL是西方人群最常见的惰性非霍奇金淋巴瘤（NHL），占西方国家所有NHL的20%~30%。t（14；18）（q32；q21）导致bcl-2/IGH重排是FL的分子标志，也是PCR检测MRD的理想靶点。
MRD状态与初治FL患者的生存具有相关性。在FOLL05试验中，将504例初治患者随机分配到3种治疗方案组，并在治疗结束时、治疗结束后12个月和24个月使用RQ-PCR检测bcl-2 IGH。24个月时的MRD阴性患者（<1×10-4）与MRD阳性患者PFS为84%比50%（P＝0.014）。MRD阴性的CR患者3年PFS率为72%，而PR患者MRD阴性和MRD阳性的3年PFS率为32%比25% （P＝0.001）[ 26 ]。该研究结果在ML17638试验中得到证实，234例初治老年患者在一线化学免疫治疗后用利妥昔单抗维持，治疗结束后使用RQ-PCR检测bcl-2/IGH，MRD阳性患者的中位PFS时间为12个月，而75%的MRD阴性患者在3年时仍为缓解状态。在治疗结束时，达到MRD阴性的CR和PR患者的3年PFS率为77%比59%（P<0.007），MRD阳性的CR患者3年PFS率为45%[ 27 ]。两项研究均表明，治疗结束后MRD阴性患者PFS更长，相较于传统疗效评价可更加准确地预测患者复发。
MRD对高危FL的预后影响已得到证实。在GITMO/IIL试验中，患者分别接受利妥昔单抗+大剂量化疗/自体移植（R-HDS）或标准R-CHOP治疗，并在诊断时、治疗结束时、治疗结束6个月以及12个月使用RQ-PCR评估134例患者BM的bcl-2/IGH残留情况，研究者定义为连续2次检测PCR阴性患者达到分子缓解（MR）。结果显示，MR率患者为60%，与没有MR的患者相比，13年OS率为82.1%比51.9%（P<0.001）[ 28 ]。这些研究表明了在FL中，MRD是一种独立的预后因素。
在最近的FOLL12研究中探讨了MRD指导FL治疗的可行性。该研究分析744例在化学免疫治疗结束评价为CR/PR的患者，通过FDG-PET和RQ-PCR检测bcl-2/IGH评估MRD水平。将患者随机分成1个对照组和3个试验组，对照组为PET-MRD阴性/阳性的患者接受利妥昔单抗维持治疗。试验组：（1）对PET阳性患者接受BTKi+R维持治疗；（2）PET阴性MRD阴性的患者进行观察；（3）对PET阴性MRD阳性的患者每周1次R维持治疗，直到达到MRD阴性。总体的结果是试验组即未接受利妥昔单抗标准维持治疗组的进展风险更高，虽然在其亚组分析中MRD阴性的患者的生存较MRD阳性患者更好，但该试验未得出MRD可作为指导治疗的指标的阳性结果[ 29 ]。MRD指导FL治疗的作用还需进一步探讨。
2.3 边缘区淋巴瘤（MZL）和淋巴浆细胞淋巴瘤（LPL）
MRD在边缘区淋巴瘤（MZL）和淋巴浆细胞淋巴瘤/华氏巨球蛋白血症（LPL/WM）的相关研究较少。在WM中，MYD88L265P已被证实是诊断和治疗反应预测的生物标志物[ 30 ]。MZL发病率低且通常不需要治疗，因此对MZL很少进行MRD监测，我们团队一项前瞻性临床试验中，71例脾MZL患者接受利妥昔单抗联合治疗方案，使用流式细胞术检测MRD，77.4%的患者达到了MRD阴性，MRD阴性患者与MRD阳性患者的5年PFS率为（74.8±6.5）%比（31.4±12.6）%（P<0.001）和5年OS率（87.2±5.6）%比（68.9±13.4）%（P＝0.035）。进行多因素分析显示，MRD阴性与MZL患者更好的生存相关[ 31 ]。总之，MRD在WM以及MZL的作用尚未明确，仍需进一步探讨。
3 MRD在侵袭性淋巴瘤中的应用现状
弥漫大B细胞淋巴瘤（DLBCL）是成年人中最常见的侵袭性B细胞淋巴瘤。DLBCL通常侵犯淋巴结，循环肿瘤负荷很低，无法通过流式细胞术检测，而常规的影像学监测效果有限[ 5 ]，如FDG-PET在治疗结束后评估疗效在伴随炎症或感染的情况下可能会出现假阳性，或者无法检测MRD而出现假阴性的结果[ 3 ]。因此利用基于PCR的技术检测特异的基因突变或ctDNA可以提高MRD检测的灵敏性[ 32 ]。美国国家癌症研究所的一项研究，使用NGS对126例DLBCL的初治患者中的ctDNA检测发现，与ctDNA MRD阳性的患者相比，MRD阴性患者的5年PFS率更高为80.2%比41.7%（P<0.000 1）[ 33 ]。在一项前瞻性研究中，对217例DLBCL患者的ctDNA通过深度测序（CAPP-seq），发现ctDNA水平在一个化学免疫治疗周期后降低2个对数级，在2个治疗周期后下降2.5个对数级的患者的无事件生存（EFS）更高（82%比46%，P<0.001）[ 34 ]。以上研究表明，在DLBCL患者中ctDNA是更灵敏的检测方法，能提供更准确的预后信息，对患者生存有更好的预测意义。
MCL是侵袭性B细胞淋巴瘤中一种少见亚型，预后较差。在MCL中，通过检测MRD来评估诱导治疗后的MCL的肿瘤负荷，相比于传统的方法，灵敏性更高。
在欧洲的2项随机试验（MCL Elderly和MCL Younger）中，在化学免疫治疗的背景下分析259例MCL患者MRD对预后的影响，结果显示，MRD阴性和MRD阳性患者的2年PFS率分别为94%比58%（P＝0.0002），且在达到MR的患者中，MRD阴性的CR/不确定的完全缓解（CRu）率和PR率为94%比100%（P＝0.0023），而MRD阳性CR/CRu率和PR率为71%比51%（P＝0.0023），且在维持治疗结束后24个月MRD阴性和MRD阳性患者MR率分别为76%比36%（P＝0.015）[ 35 ]。这表明MRD状态不仅与患者PFS时间相关，而且与反应持续时间相关。
MRD检测对诱导治疗后进行自体干细胞移植（ASCT）的患者的生存有高度预测性。在MCL3 Nordic研究中，诱导治疗后对未达到CR的患者进行ASCT，并在移植前后对患者BM或PB进行MRD评估，MRD阳性的患者的PFS和OS显著降低，MRD阴性率从移植前53%增加到移植后83%，并且移植后MRD仍为阳性患者复发风险增加了4倍[ 36 ]。而另一项研究纳入29例接受化疗和ASCT治疗的MCL患者，并通过RQ-PCR进行MRD检测，研究发现，在ASCT后52%的患者达到MRD阴性，且MRD阴性组PFS优于MRD阳性组（92个月比21个月，P<0.001）[ 37 ]。以上研究表明对MCL患者进行MRD监测，有助于了解缓解深度及复发风险，并在诱导治疗结束后进行ASCT治疗可以加深缓解生命质量并延长生存。
4 结论及未来展望
近年来随着分子生物学技术在淋巴瘤中的应用，MRD的作用逐渐凸显，多色流式、RQ-PCR及NGS技术存在各自优势，在不同淋巴瘤中得到了不同的应用。在CLL中，已经将MRD作为患者是否停药的评估工具。在侵袭性淋巴瘤中，过ctDNA监测肿瘤残留，也许可以早于影像学提示患者进展，及时调整患者治疗。总之，随着MRD检测手段的不断发展，将来有可能使MRD检测成为淋巴瘤患者的常规管理的一部分，从而对每个患者进行更加个体化和动态化的治疗监测。
参考文献：略
引用本文: 黄燕姗,邱录贵,易树华. 微小残留病监测在B细胞淋巴瘤中的研究进展[J]. 白血病·淋巴瘤,2023,32(06)：373-377.DOI:10.3760/cma.j.cn115356-20220727-00220
责任编辑：Amiee
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