乳腺癌是目前最常见的女性恶性肿瘤，乳腺癌的早期诊断缺少高敏感度和高特异度的肿瘤标志物。临床工作中大多数乳腺癌患者因发现乳房肿块而确诊，病程往往处于进展的中晚期，耽误患者的治疗时机且影响患者的预后。伴随着相应学科技术的发展进步，液体活检技术以其技术优势迅速成为研究热点，展现出巨大的潜在的临床应用价值和前景，为乳腺癌的早期诊断另辟佳径。本文主要对液体活检技术中循环肿瘤DNA（ctDNA）、循环肿瘤细胞、外泌体、肿瘤诱导血小板（TEPs）等肿瘤标志物在乳腺癌早期诊断中应用的研 究进展进行综述。
耿亚星,李玉惠,黄国民.液体活检技术在乳腺癌早期诊断中应用的研究进展[J].现代肿瘤医学,2023,31(19):3710-3714.
乳腺癌(breast cancer，BC)近年来已跃居全球女性肿瘤发病率的首位，是女性最常见的恶性肿瘤，严重威胁着女性的健康[1]。当前中国乳腺癌的发病率以2%左右的速度逐渐上升[2]，且呈现年轻化趋势。乳腺癌的早期诊断能够使患者获得更及时更好的治疗，并有质量的延长患者的生命[3]，因此早期发现和诊断能够提高乳腺癌的治愈率和生存率，降低复发率和病死率[3]。临床上目前乳腺癌肿瘤标志物多为糖类抗原CA153的检测，但CA153在疾病早期敏感度较差，达不到疾病早期诊断对标志物敏感、特异的要求。乳腺癌诊断的金标准依然为组织病理检查，但多数患者由于乳房肿块就诊行穿刺活检时可能已延误诊疗[5]。伴随着生物分子层面对乳腺癌研究的不断深入，现已证实，乳腺癌的发生和进展伴随着机体代谢异常[6]。液体活检作为一种新型的生物分子技术，可以通过提取、分析乳腺癌患者疾病发生和发展过程中体内代谢物种类和数量的变化，发现乳腺癌早期诊断的新型标志物。液体活检技术满足人们对乳腺癌早期诊断相关的肿瘤标志物的高要求[7]，乳腺癌早期诊断新型标志物的发现受到临床广泛的关注。本文主要对液体活检技术中循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)、循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)外泌体(exosomes)、肿瘤诱导血小板(tumor-educated platelets,TEPs)等乳腺癌相关的代谢标志物在疾病早期诊断中应用的研究进展进行综述。
1. 液体活检技术
通过检测分析患者体液标本进行诊断的技术，称为液体活检技术。它主要以外周血、尿液、唾液、胸腹腔积液、脑脊液等作为检测标本，检测ctDNA、CTCs、外泌体及TEPs等物质。多项临床试验证，液体活检技术灵敏度较高，其相应标志物往往在临床表现和影像学显示病变之前就能进行早期肿瘤筛查[8]。而且液体活检技术具有取样简便、有创伤害小及可重复操作等优点。它有望被广泛的应用于肿瘤的诊疗，为乳腺癌的早期诊断提供依据[9,10]。
2. 乳腺癌与液体活检技术
2.1 乳腺癌与ctDNA
2.1.1 ctDNA的特点及检测原理
ctDNA是指患者血液来源的肿瘤细胞坏死、凋亡或者分泌的DNA小片段，长度一般不超过160~180 bp，明显短于正常细胞内的DNA，因此又称为外周游离血DNA(circulating free DNA,cfDNA)[11]。存在于血浆或血清中的ctDNA，可反映肿瘤的特异性[12]。当机体未患肿瘤时，体液内ctDNA含量较低，而当机体发生肿瘤时，因为循环癌细胞发生坏死和凋亡，使体液内的DNA含量显著升高，从而使ctDNA水平明显高于健康人群[13]。由于检测设备和技术的不完善，ctDNA 的检测难度较大，使早期乳腺癌患者ctDNA检测应用受到一定限制，伴随着相应高敏感度检测技术和设备的发展，使应用受到限制的早期乳腺癌患者ctDNA检测的巨大的辅助诊断价值展现出来[14]。由于ctDNA是由血浆、血清等较为容易获得的检测标本分离而来，具有简单好操作有创伤害小、半衰期短、实效性佳等优点，在乳腺癌早期诊断中得到了极大关注[14]。
2.1.2 ctDNA在乳腺癌早期诊断中的应用进展
在乳腺癌的早期诊断方面，ctDNA比传统乳腺癌肿瘤标志物具有更高的灵敏性和特异性[15]。有研究显示通过比较乳腺癌患者糖类抗原CA153、CTCs、相关的影像学检查与ctDNA检测共四种方法所展示的敏感度，结果显示ctDNA可对肿瘤有更好的反应。在STOETZER 等[17]的实验中发现乳腺癌患者体液中的ctDNA含量与未患病人群相比有显著增高(P<0.001)。在季福庆等[18]的实验中也验证了这一结论，观察组(患者)ctDNA含量明显高于对照组(健康体检),差异有统计学意义(P<0.05)。YOSHINAMI 等[19]研究结果表明，对于乳腺癌突变的MB-NGSA患者可以在早期乳腺癌患者诊断时高灵敏度地检测ctDNA，并且它似乎有可能作为临床上有用的肿瘤标志物来预测其预后。而且ctDNA的检测更适用于中国人群的诊断，漏诊率及误诊率均较低，在临床实践过程中可通过结合其他临床资料提高对乳腺癌的诊断准确性[20]。ctDNA技术研究目前仍处于初始阶段，在临床上推广面临着技术不成熟、检测成本高、缺乏大数据研究支持验证等挑战。ctDNA技术除了应用于乳腺癌的早期诊断，还具有肿瘤负荷监测、治疗效果评价、复发转移风险评估等作用，还具有对肿瘤分期的优势，虽然并不能确定肿瘤的病理分型，但是肿瘤早期发现及诊断的目的已经达到。
2.2 乳腺癌与CTCs
2.2.1 CTCs的定义及检测方法
原发或继发肿瘤细胞脱落入外周血循环，经过游走、黏附而形成转移灶的肿瘤细胞，称为CTCs[21]。从实体肿瘤组织脱落到血循环的CTCs，它与原发肿瘤有相近的基因特征，表达与来源肿瘤相似的特异性抗原或遗传特性[22]。由于CTCs计数具有波动性小，特异度相对更高的优势，CTCs计数在早期检测肿瘤时可以做到早于影像学检查[23]。但是外周血循环中的肿瘤细胞由于血液中多种物质干扰，且CTCs的数量通常较低，并且大多数CTCs在循环过程中死亡，其检测与分离有一定的难度l24-251现在免疫组化技术、流式细胞技术(flow cytometry,FCM)、聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-PCR，RT-PCR)、激光扫描细胞计量技术、CellSearch技术等均得到了发展可以用来检测CTCs，使检测CTCs成为可能，可提供更为精确的检测方法来诊断、治疗肿瘤[26]。
2.2.2 CTCs在乳腺癌早期诊断中的应用进展
有实验研究发现乳腺癌患者外周血中CTCs的检出率明显高于乳腺良性病变，两者比较差异有统计学意义(P<0.05)，CTCs可作为肿瘤的早期诊断、分期、预后以及疗效评估的一种新的诊断指标”[27]。德国妇科肿瘤学工作组(Arbe-itsgemeinschaft Gynakologische Onkologie，AGO)指南推荐: CTCs可作为早期乳腺癌患者的预后指标，并可作为无症状患者的常规随访检查项目之一[28]。研究表明CTCs是上皮来源恶性肿瘤侵袭和转移的早期事件，其在乳腺癌早期阶段就能产生[29]。在一项随访3年的研究中发现乳腺癌患者具有较高的外周血CTCs阳性率，乳腺癌外周血CTCs检测阳性时间明显早于临床确诊时间，CTCs阳性至少可比临床确诊转移时间提前12周血。但是目前临床上多数相关的研究是关于CTCs在乳腺癌临床分期、治疗疗效评估、预后及术后复发等方面，关于CTCs在乳腺癌的早期临床诊断的研究相对较少。所以CTCs在乳腺癌早期诊断中的应用有待进一步研究发掘。
2.3 乳腺癌与外泌体
2.3.1 外泌体种类及特点
外泌体是一种直径为30~150 nm 的细胞外囊泡，由脂质双分子层包裹各种核酸(如DNA、miRNA)、蛋白质(如细胞内骨架蛋白、跨膜蛋白以及热休克蛋白)酶(如GAPDH、ATPase)脂质体、抗原、糖类等形成的囊泡类小体。外泌体形态不同，可携带丰富的生物活性分子，这些分子通常反映了外泌体起源细胞相关遗传信息，外泌体释放后具有较好的稳定性，选择性携带其亲代细胞特性的生物活性物质且在体液中的含量高，因此具有较佳的灵敏度和特异度[31-35]。外泌体是肿瘤微环境的一部分[36]，携带着亲代细胞特性的物质在人体过度表达，揭示外泌体在疾病的诊疗中具有潜在标志物的特点[37]。癌细胞分泌外泌体的含量相对于正常细胞多至少10倍以上，外泌体存在于如外周血、唾液、尿液脑脊液、关节液精液、羊水腹水等体液中[38-39]。
2.3.2 外泌体在乳腺癌早期诊断中的应用进展
外泌体miRNA水平不仅反映其起源细胞遗传特性，还具有分辨乳腺肿瘤亚型的潜能[40]。研究发现hsa miR-486-5p在乳腺癌发生进展的各个阶段的组织和血清中均随疾病进展呈下调状态，在早期乳腺癌患者血清中呈明显低表达，与乳腺癌分子分型无关(P>0.05)。但早期乳腺癌组低表达的血清hsa-miR-486-5p与正常对照组相比呈显著差异性(P<0.01)，血清hsa-miR-486-5p可以作为诊断早期乳腺癌的生物标志物，具有较高的临床应用价值[41]。焦东晓等[42]在实验中发现miR-199b-5p和miR-597对乳腺癌早期预测的受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve,ROC)的曲线下面积(area under the curve,AUC)分别为0.813和0.721，提示miR-199b-5p和miR-597是乳腺癌早期诊断的较好指标。一项研究结果显示，miR-145和miR-451的组合是鉴别乳腺癌与健康对照者和所有其他类型癌症的最佳生物标志物(P<0.0001)。在盲法验证中，这些血浆标志物产生的AUC为0.931，阳性预测值为88%，阴性预测值为92%。血浆中这些miRNAs水平的改变不仅在肿瘤的晚期也在早期被检测到。循环miRNAs 对导管原位癌阳性预测值为96%，提示循环miRNAs可作为早期乳腺癌筛查的特异性生物标志物。以上研究提示可将这些外泌体特异性标志物纳入乳腺癌的早期诊断标准[43]。外泌体在乳腺癌不同阶段起到重要作用，除了关于外泌体在乳腺癌早期诊断的实验研究外，还有一些研究发现外泌体还参与乳腺癌的发生、促进乳腺癌的转移、乳腺癌治疗的耐药等过程，外泌体存在更大的可发掘临床应用潜能，可依据乳腺癌发生发展过程中外泌体所起的作用，发挥它的优势功能，规避它的弊端，或者转化它的缺点为优势所在。因外泌体还处于实验室研究阶段，并未在临床上得到实施，精准度和安全性也有待提高，更未形成大数据支持的公认的有共识的临床诊断标准，所以在乳腺癌早期诊断的应用上还需要进一步的探讨。
2.4 乳腺癌与TEPs
2.4.1 TEPs的形成及作用机制
血小板是骨髓中成熟巨核细胞胞浆解脱落下来的无核的最小的血细胞，它含有较少种类的蛋白质和RNA。平均寿命为7~10天[44]。血小板的主要功能是凝血和止血，但研究发现它们助力癌症的形成，所以它又称为肿瘤影响血小板(tumor-influenced platelets)或肿瘤决定血小板(tumor-con-ditioned platelets)[45]。在肿瘤微环境中血小板通过活化形成肿瘤细胞诱导血小板聚集的聚集物，不仅分泌生长因子促进细胞生长和血管生成，还在继发部位为原发肿瘤建立一个生态位，同时招募粒细胞和单核细胞共同构成肿瘤微环境。两者在肿瘤微环境中相互作用使血小板内mRNA表达存在差异，影响肿瘤的生长和扩散[46-48]。
2.4.2 TEPs在乳腺癌早期诊断中的应用进展
BEST等[49]将实验者和对照者共283份血小板样本的mRNA进行测序，准确率为96%，TEPs改变了它们的RNA 谱，研究结果表明，血小板为癌症辅助诊断提供了一个有价值的平台，使基于血液的“液体活检”的临床进展成为可能。LIEFAARD等[50]对265例I-IV期乳腺癌患者、216例无症状女性对照者、144例非癌性疾病患者和321例女性患者患有其他肿瘤的实验研究发现在早期乳腺癌患者和非癌症样本中，AUC为0.72(95%CI:0.66~0.79,P<0.001)。该研究在一个确认和筛选的环境下进行验证，提示从TEPs中提取的RNA信号可以早期检测乳腺癌。所以TEPs可以被开发为早期癌症检测或癌症转移的生物标志物[44]。优点在于在循环中TEPs相比于CTCs数量丰富，更容易提取纯化，循环中也不容易被破坏。但是关于TEPs还有众多问题尚未得到解决，检测的可重复操作性有多强，将检测分析实现临床上应用需要简化检测分析步骤，这样是否会失去检测的准确性等问题有待进一步探讨。因此，TEPs作为乳腺癌早期诊断指标是具有研究价值和前景的，但还是需要研究更进一步的探索。
3. 小结和展望
在精准医学和个体化诊断、治疗的趋势下，液体活检技术在临床研究与实践中发挥着越来越重要的作用，为恶性肿瘤的分子诊断水平提供了精确的技术支持，在疾病发生的早期提高了诊断的灵敏度和特异度，为患者争取更好治疗时机及治疗效果。当然病理组织活检依然为疾病诊断的金标准，但是它的均适性和有创性限制了它在疾病早期诊断的广泛应用，而液体活检技术相关的检测指标较影像学检查、其他检验指标及组织活检能够更早地发现肿瘤，具有可重复性和无创性的优势，但是还存在一些问题亟待解决，它需要在临床上更大范围实验得到大数据支持才能在临床上推广、需要有特异度的检测指标及检测标准的建立、需要技术的成熟完善及成本的控制等一系列问题的解决。解决问题的动力是为患者的利益出发，虽然在前进的道路上有绊脚石，但依然不会削减我们推开它继续前进的决心。
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