三阴性乳腺癌是一种高异质性疾病，目前仍是乳腺癌治疗中最具挑战性的亚型。多组学技术为了解肿瘤异质性提供了更广阔的视野。在2022年第45届圣安东尼奥乳腺癌研讨会（SABCS）中，复旦大学肿瘤中心团队的乳腺癌多组学研究被大会入选[1]。该研究通过多组学分析发现了TNBC中的铁死亡异质性特征，并深入挖掘铁死亡调控机制，为TNBC治疗提供了崭新的思路。
方法
• 多组学综合分析TNBC的铁死亡特征（图1A）；
• 联合分子生物学技术探索铁死亡调控机制（图1B）；
• 体内外实验验证铁死亡靶点的有效性（图1A）[2]。
图1 A研究方法及流程；B铁死亡及其调控。
结果
TNBC多组学分析：铁死亡相关途径在LAR亚型中高度富集
• 铁死亡相关途径富集评分显示，不同TNBC亚型具有不同的铁死亡特征（图2C）。转录组水平上，雄激素受体（AR）途径活化的TNBC LAR亚型以FA合成、ROS累积和GSH代谢途径等多条铁死亡相关途径的激活为特征（图2C）。代谢组水平上，LAR肿瘤表现为：OxPE丰度（图2D）及OxPE/PE-PUFA比值（图2H）均升高；FA代谢方面，PUFA耗竭但棕榈油酸、油酸丰度特征性升高（图2D）。
• 细胞及临床肿瘤样本检测验证：LAR细胞/组织中，铁死亡相关基因SREBP1、ALOX15和GPX4 mRNA（图E）及蛋白（图F）表达均上调。细胞检测验证：LAR细胞系中脂质过氧化物含量升高（图I）。
图2C铁死亡相关途径富集评分（转录组水平）；D.铁死亡相关脂质标准化丰度（LAR vs. 非LAR）；E.HAMP、SREBF1、ALOX15和GPX4 mRNA表达（LAR vs. 非LAR肿瘤）；F. HAMP、SREBF1、ALOX15和GPX4蛋白表达（LAR vs. 非LAR细胞系/临床肿瘤样本）；H. OxPE/PE-PUFA比值（LAR vs. 非LAR）；I. 脂质过氧化物含量（LAR vs. 非LAR vs.阴性对照）。
• 小结：不同TNBC亚型的铁死亡特征迥异。LAR亚型以铁死亡相关途径上调和富集OxPE为特征，可能对铁死亡敏感。
GSH代谢对抑制LAR铁死亡至关重要，GPX4为GSH代谢的关键分子
代谢组水平上，差异丰度（DA）评分分析结果显示，LAR中，GSH代谢的铁死亡抑制特征和可靶向性最为显著（图3A、B）。LAR肿瘤中，富集GSH循环的核心代谢产物（图3C、E）、GSH/GSSG比率升高（图3D）；细胞实验进一步验证GSH/GSSG比率在LAR细胞系中升高（图3F）；
图3 A. 代谢组DA分析评分（LAR vs. 非LAR肿瘤）；B. 代谢组DA分析评分（LAR肿瘤 vs. 正常组织）；C. GSH代谢途径；D. GSH/GSSG比值（LAR vs. 非LAR肿瘤）；E. GSH循环代谢产物相对丰度（LAR vs. 非LAR肿瘤）；F. GSH/GSSG比值（LAR vs. 非LAR细胞）。
• 转录组水平上，富集评分进一步验证，GSH代谢途径在LAR肿瘤的铁死亡抑制中必不可少（图4G）。
• TNBC细胞系/临床肿瘤样本蛋白表达检测（图2F）、肿瘤mRNA差异表达分析（图4H）、METABRIC和TCGA-TNBC数据集mRNA表达比较（图4I）均显示：在GSH途径的所有代谢酶基因中，GPX4具有区分LAR及非LAR乳腺癌的功能（图4H）。
图4 G.转录组水平，铁死亡相关途径富集评分（LAR vs. 非LAR肿瘤）；H LAR肿瘤中，GSH代谢相关基因的表达和差异表达分析；I METABRIC和TCGA-TNBC数据集中，GPX4 mRNA表达比较。
• 小结：GPX4是GSH代谢的关键分子，后者能调控TNBC LAR的铁死亡，靶向抑制GPX4或为LAR治疗新策略。
LAR对抑制GPX4的铁死亡诱导剂高度敏感，GPX4是LAR的潜在靶点
• 以铁死亡诱导剂干预乳腺癌细胞（图5A），GPX4抑制剂RSL3显著抑制LAR细胞活性（图5B左上），并且，RSL3对LAR的生长抑制显著强于其对非LAR细胞的抑制（图5B左上、右上及右下）。集落形成实验（图5C）和患者类器官模型（5D）同样证实LAR肿瘤对GPX4抑制剂高度敏感。
图5 A研究使用的铁死亡诱导剂；B不同铁死亡诱导剂对不同亚型乳腺癌细胞存活的影响；C GPX4抑制剂不同亚型TNBC细胞存活的影响；D. RSL3对不同亚型类器官的活性的影响。
• 小结：LAR对GPX4抑制剂高度敏感，GPX4可能是LAR肿瘤的代谢性治疗靶点。
AR是调控LAR肿瘤GPX4表达的关键分子，通过结合GPX4启动子促进其表达
• 与非LAR肿瘤比较，分析LAR在基因集富集（图6B）、外显子突变（图6C）和拷贝数变异（图6D）上的特征性变化，定义为LAR特异性事件。GPX4表达与LAR特异性事件相关性分析结果显示，雄激素应答、PI3K信号突变、MAPK信号突变等与GPX4表达正相关（图6E），是潜在的GPX4调控机制途径；
将上述途径的抑制剂干预不同的人乳腺癌细胞系后，除GPX4抑制剂外，仅AR抑制显著下调GPX4蛋白表达（图6F）；在人乳腺癌细胞系中过表达/敲减AR基因以验证该结果，结果GPX4 mRNA表达也相应上调/下调（图G/H）。
图6A定义LAR特异性事件流程图；B基因集富集分析（LAR vs. 非LAR肿瘤）；C致癌途径突变率（LAR vs. 非LAR肿瘤）；D体细胞CNVs（LAR vs. 非LAR肿瘤））；E LAR特异性事件与GPX4表达的相关性分析；F人乳腺癌细胞系中验证通路抑制剂对GPX4蛋白表达的调节作用；G AR过表达乳腺癌细胞系中GPX4 mRNA表达；H AR敲减乳腺癌细胞系GPX4 mRNA表达
• 荧光素酶报告基因检测明确AR与GPXF4的结合位点。如图7I-K所示，AR与GPX4启动子-2,500 - -2,000区域结合并促进后者表达。
图7 I共转染Flag-AR后，GPX4启动子-2,500 - -2,000区域的荧光信号增强; J该区域有4个AR结合域；K突变（ABS1/2/3/4-Del和all-ABSs-Del）结合域能抑制AR诱导的转录上调
AR通过增加PUFA合成促进LAR铁死亡，靶向GPX4是更合理的药物策略
• 以AR和GPX4抑制剂干预乳腺癌细胞，仅GPX4抑制剂提高脂质过氧化水平（图8A）和铁死亡标志物蛋白表达（图8B）。
• 在AR抑制剂干预后的LAR细胞中，DECR1表达上调（图8C）；LAR肿瘤组织中，DECR1表达与OxPE 18:1-20:4+4O丰度负相关（图8D）；而GPX4抑制剂（而非AR抑制剂）干预后的LAR细胞中，脂质过氧化标志物MDA的表达升高（图8C）。既往研究也显示，AR通过下调DECR1增加PUFA合成从而促进铁死亡。因此，研究认为，AR在LAR铁死亡中可能具有双重作用：一方面上调GPX4表达清除脂质过氧化物，另一方面增加PUFA合成促进铁死亡（图8E）。
图8 以AR/GPX4抑制剂分别干预乳腺癌细胞：A脂质过氧化水平；B铁死亡标志物蛋白表达。C AR抑制剂对LAR细胞DECR1蛋白表达的影响；D LAR肿瘤中，DCER1表达与OxPE 18:1-20:4 +4O丰度相关性分析；E AR在铁死亡中的双重作用
• 小结：AR在LAR铁死亡具有上调GPX4表达和促进铁死亡的双重作用。因此，GPX4抑制剂，而非AR抑制剂是治疗TNBC LAR更为明智的选择。
GPX4抑制剂有显著的体内抗肿瘤活性
• TS/A为富集铁死亡相关途径的小鼠LAR肿瘤细胞系（图9A），向裸鼠注射TS/A建立LAR动物模型。通过GPX4抑制剂和Gpx4低表达细胞株验证GPX4抑制剂治疗LAR的可行性（图9B）。
• Gpx4低表达/GPX4抑制剂显著抑制肿瘤生长（图9C）。肿瘤免疫组化结果显示，铁死亡生物标志物表达升高（图9D）；细胞流式分析显示，肿瘤组织免疫细胞微环境发生变化（图19F）。
图9A TS/A细胞系代谢特征；B体内实验流程图；C抑制GPX4表达对肿瘤生长的影响；D抑制GPX4表达对肿瘤铁死亡的影响；E抑制GPX4表达对肿瘤免疫细胞亚群的影响
• 小结：体内研究结果说明，抑制GPX4在LAR中的表达可有效遏制肿瘤生长，其机制为促进肿瘤铁死亡，也可能与调节肿瘤免疫细胞微环境有关。
GPX4抑制剂联合免疫治疗对生物学特征与LAR相似的肿瘤同样有效
• 在GPX4抑制剂基础上，联合PD-1抑制剂干预LAR荷瘤小鼠（图10A）。
• 与GPX4抑制剂或PD-1抑制剂单药相比，两者联用更显著地抑制肿瘤生长（图10B）。细胞流式分析显示，药物联用可诱导肿瘤免疫应答，PRF1+CD8+ T细胞和GZMB+CD8+ T细胞比例均有升高（图10C）。
图10 A联合治疗体内实验流程图：B. 联合治疗对肿瘤生长的影响；C. 联合治疗对肿瘤免疫细胞亚群的影响
• 分析21例经新辅助免疫治疗TNBC患者（I-SPY2研究队列）的RNA-seq（图11D），在AR高表达患者中，铁代谢、不饱和脂肪酸和GSH代谢活性均增加（图11E）；GSH代谢与M2型巨噬细胞比例正相关，与PD-1、PD-L1等负相关（图11F）；另外，而GSH代谢水平较高患者的非pCR比例高于代谢水平较低的患者（图11G）。
图11D乳腺癌患者RNA-seq分析流程图：E代谢组学富集分析比较（AR高表达 vs. AR低表达）；F GSH代谢相关性分析；C pCR比例（GSH代谢活性强 vs. GSH代谢活性低）
• 分析小鼠肿瘤样本的RNA-seq（图12H），AR高表达肿瘤具有与LAR相似的代谢组学特征（图12I），其GSH代谢水平与免疫相关标志物相关分析结果与I-SPY2研究队列中的一致（图11F、图12J）。另外，GPX4在免疫耐药小鼠的肿瘤组织中表达升高（图12K）。
图11 H肿瘤小鼠RNA-seq分析流程图；I小鼠肿瘤代谢组学富集分析；J GSH代谢的相关性分析；K AR高表达肿瘤中，GPX4表达比较（免疫耐药 vs. 非耐药小鼠肿瘤）
小结：体内实验及生物信息学分析一致显示，对于生物学特征类似LAR的肿瘤，GPX4抑制剂联合免疫治疗或为极具前景的治疗策略。
小结
• 不同TNBC转录组亚型具有不同的铁死亡特征，LAR亚型以铁死亡途径高度富集为显著特点；
• LAR亚型对铁死亡诱导剂（尤其是GPX4抑制剂）高度敏感；
• GPX4抑制剂联合免疫检查点抑制剂的抗肿瘤效果为LAR及生物学特征与之类似的肿瘤提供了新的治疗策略。
CN-108012
有效期至：2023-12-28
1. Yang F, Xiao Y, Ding JH, Jin X, Ma D, Li DQ, Shi JX, Huang W, Wang YP, Jiang YZ et al: Ferroptosis Heterogeneity in Triple-Negative Breast Cancer Reveals an Innovative
Immunotherapy Combination Strategy. In: 2022 SABCS®. San Antonio; 2022.
2. Yang F, Xiao Y, Ding JH, Jin X, Ma D, Li DQ, Shi JX, Huang W, Wang YP, Jiang YZ et al: Ferroptosis heterogeneity in triple-negative breast cancer reveals an innovative immunotherapy combination strategy. Cell Metab 2022.
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