淋巴瘤相关巨噬细胞（LAMs）是淋巴瘤微环境中的关键组成部分，它可能影响疾病进展和治疗反应。LAMs主要有两种亚型，CD68+ M1型和CD163+ M2型。M2型 LAMs可由M1型LAMs转化而来的，特别是在某些弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）中。虽然套细胞淋巴瘤（MCL）含有大量上皮样巨噬细胞，但LAMs的特征尚不清楚。因此，本文研究评估了MCL患者的免疫表型亚型、免疫检查点分子PD-L1的表达，以及LAMs对MCL预后的影响。
研究背景
MCL占非霍奇金淋巴瘤的5~6%，由于CCND1-IgH基因重排导致细胞周期蛋白D1特征性表达。MCL具有广泛的形态学特征与异质性临床结局有关。MCL患者通常多表现为晚期，临床病程具有侵袭性。尽管MCL患者治疗效果得到显著改善，但其长期预后仍然很差，中位总生存期为3~5年。然而，约15%的MCL患者临床病程缓慢，总生存期为7~10年(5~7年)。因此，有必要识别MCL的不同预后亚组，并根据危险分层调整治疗策略。
近年来，对肿瘤微环境和免疫治疗的研究日益深入，特别是在乳腺癌、肺癌和黑色素瘤等实体瘤中，其中研究最广泛的免疫治疗生物标志物是程序性死亡-1受体(PD-1，CD279)及其配体PD-L1(CD274，B7-H1)和PD-L2(CD273，PDCD1LG2，B7-DC)。PD-1和PD-L1/PD-L2相互作用可以诱导肿瘤细胞发生免疫逃逸，而通过靶向PD-1或其配体来恢复效应T细胞的功能可逆转逃逸的发生。在造血系统中，PD-L1在抗原提呈细胞和活化的T细胞中表达。某些类型的B细胞淋巴瘤可表达PD-L1，包括经典型霍奇金淋巴瘤(cHL)、结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤(NLPHL)和部分弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)亚型，PD-1或PD-L1阻断免疫疗法在这些淋巴瘤中显示出一定发治疗反应。目前探索MCL免疫微环境的研究相对较少。在MCL中，淋巴瘤细胞和微环境中PD-L1的表达水平较低，PD-L1的表达对临床治疗和生存是否有意义尚不确定。此外，MCL免疫治疗效果并不理想。MCL细胞上PD-L1的表达可诱导抗肿瘤免疫反应的抑制。因此，靶向PD-L1治疗可能是提高免疫治疗疗效的新途径。
巨噬细胞是肿瘤微环境的重要组成部分，几乎所有类型的淋巴瘤都存在数量不等的巨噬细胞，其被称为LAMs。LAMs根据其免疫表型分为两个主要亚型：M1和M2亚型，其功能在不同的淋巴瘤类型中不同。M1型LAMs可抑制肿瘤生长，而M2型LAMs与血管生成和肿瘤进展有关。CHL、DLBCL、滤泡性淋巴瘤(FL)和血管免疫母细胞性T细胞淋巴瘤(AITL)中，大量LAMs的存在与侵袭性临床病程密切相关。然而，LAMs在MCL中的意义尚未确定。只有少数研究将巨噬细胞数量与MCL的预后联系起来，然而LAMs在MCL中的功能作用研究仍不足。因此，有必要进一步研究LAMs在MCL中的特性和生物学功能。在这项研究中，在本研究中，研究者探索了MCL中LAMs的数量、亚型和PD-L1的表达情况，并评估了其对预后的影响。
研究方法
本研究共纳入82例符合条件的MCL病例，并收集每个病例的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织构建组织芯片（TMA）。采用定量方法评估CD68和CD163的免疫组化染色。采用多重免疫荧光技术检测CD68+的M1型LAMs和CD163+的M2型LAMs上PD-L1的表达水平。应用数字图像分析的自动化方法评估MCL中Ki67增殖率。采用X-Tile软件确定区分总生存率（OS）的最佳截断值。
研究结果
临床和病理学特征
表1总结了82例MCL患者的临床和病理资料。患者以男性为主，男女之比约为3：1，确诊时中位年龄为67岁(37~92岁)。30%(22/74)的患者出现全身症状，包括疲劳、发热和体重减轻。81%(48/59)的患者伴有骨髓受累。大多数患者(67/70；96%)临床分期为晚期(III/IV)。50例患者可计算sMIPI评分，其中18例(36%)为低危，22例(44%)为中危，10例(20%)为高危。在75例有临床治疗资料的患者中，67例(87%)患者接受了化疗和/或放射治疗，其余8例(13%)正在观察中，未接受治疗。63例患者对治疗有反应：38例患者(60%)完全缓解，13例(21%)为部分缓解，12名(19%)持续或疾病进展。化疗后，24/68(35%)患者接受了异基因造血干细胞移植。临床随访81例，中位病程为36个月(1~221个月)，死亡46例(57%)。
表1. 82例MCL患者的临床病理特征
在TMA上，每个MCL病例有两个独立的1.0 mm组织芯，且具有代表性的淋巴瘤组织(图1A)。不同数量的上皮样组织细胞与肿瘤细胞混合在一起(图1B)。绝大多数MCL组织中CD5(45/50，90%)、细胞周期蛋白D1(79/80，99%)和SOX11(69/79，87%)均呈阳性表达。29例中仅2例(7%)表达CD10，Bcl6阴性有21例，CD23阴性有14例。32例患者进行了CCND1重排的FISH检测，其中28例(88%)为阳性。
图1. 组织芯片（TMA）构建和CD68及CD163的免疫染色。(A)TMA上每个MCL病例有两个独立的1.0 mm组织芯（H&E，原始放大倍数×20）。(B)分散的上皮样组织细胞与丰富的淋巴瘤细胞（H&E，×400）混合，采用CD68（C，×400）和CD163（D，×400）进行免疫染色以突出显示。
CD68+和CD163+巨噬细胞数量与总存活率关系
对TMA切片进行CD68和CD163的免疫组化染，并由病理学家在每个病例的4个具有代表性的400×区域上手动记录阳性细胞的数量。在排除9例染色不佳或组织不足的病例后，共纳入73例MCL。CD68+的细胞平均为170个（范围29-493），CD163+细胞为57个（范围0-519）（图2A，B）。CD68+巨噬细胞的数量高于CD163+巨噬细胞，总体CD68：CD163的比例为3：1。此外，CD163+巨噬细胞的计数范围更广，更易出现低频计数。根据CD68+或CD163+巨噬细胞的数量预测MCL患者的OS。X-Tile软件将CD68+巨噬细胞中位数（50%）设为截断值，CD68+计数较低的患者(n=36)OS明显优于CD68+计数较高的患者(n=37)(图2C)。X-Tile软件将CD163+巨噬细胞最佳截止值设置为90%，CD163+巨噬细胞低的患者(n=66)的OS优于CD163+巨噬细胞计数较高的患者(n=7)(图2D)。
图2. 人工计数73例MCL患者CD68+(A)和CD163+(B)巨噬细胞数量。CD68+计数较低(C)的MCL比计数较高的MCL总生存率（OS）更好；CD163+巨噬细胞计数较低(D)也预示着OS的改善。
CD68、CD163和PD-L1表达水平与总生存期关系
该研究采用多重免疫荧光定量分析法检测CD68、CD163和PD-L1在TMA切片上的表达，其中PD-L1表达与CD68或CD163共定位(图3A-J)。
图3. 多重定量免疫荧光分析。CD68 (A、F）、CD163 (B、G）和PD-L1 (C、H）的免疫荧光染色。CD68和CD163的共定位（D，I）。CD68、CD163和PD-L1共定位（E，J）。
采用X-Tile将CD68表达的最佳生存曲线截断值设为90%，CD68低表达组(n=66)患者的OS明显好于高表达组(n=7)(p=0.002)(图4A)。将CD163表达的最佳界值设定为80%，CD163低表达的病例(n=57)OS明显好于高表达的病例(n=16)(p=0.001)(图4B)。对于PD-L1在CD68+巨噬细胞上的表达水平，X-Tile将其最佳截断值设为65%，CD68+细胞上PD-L1高表达的(n=47)患者OS略好于低表达35%(n=26)，但无统计学意义(p=0.097)(图4C)。检测CD163+巨噬细胞上PD-L1的表达，X-Tile将其最佳截断点设定为80%，CD163+细胞上PD-L1低表达的患者(n=57)OS略好于高表达20%的患者(n=16)，但无统计学意义(p=0.120)(图4D)。
图4. 通过多重定量免疫荧光分析评估CD68、CD163和PD-L1的表达。CD68 (A)和CD163 (B)的低表达与更长的OS显著相关。PD-L1在CD68+细胞上的表达增加OS (C)略好，而PD-L1在CD163+细胞上的高表达与(D)预后较差相关，但两者均无统计学意义
Ki67细胞增殖指数的预后价值
共有69例MCL患者TMA切片组织可用于检测Ki67染色，包括52例男性和17例女性，患者中位年龄68岁(37-92岁)，中位生存期35个月(1~213个月)。用Aperio扫描仪扫描Ki67染色的TMA玻片，然后用QuPath程序分析阳性细胞(图5A-D)。对于每个病例，使用组织芯中所有细胞的Ki67阳性细胞来评估Ki67增殖指数，并计算两个组织芯的平均百分比(图5E)。X-Tile确定Ki67增殖指数的最佳截断值为31.9%，与临床上30%的截断值非常接近。大多数病例(61/69，88%)Ki67增殖率<30%，其余8例(12%)>30%。Ki67增殖指数<30%的患者的中位生存期为52个月，明显长于Ki67>30%的患者(中位生存期8个月；p=0.021)(图5F)。高Ki67组(>30%)患者CD68+M1型LAMs数显著高于低Ki67组(<30%)(p=0.018)。高Ki67组CD163+M2 LAMs数也高于低Ki67组，但差异无统计学意义(p=0.17)。
图5. 使用QuPath DIA评估Ki67的增殖率。Ki67免疫染色前(A)、及染色后（B）的TMA图像。一例患者高倍镜下细胞检测及阳性细胞检测前(C)和检测后(后)。(E)73例MCL患者Ki67增殖率的动态百分比范围。(F)Ki67增殖率高（>30%）与低（<30%）患者的Kaplan-Meier曲线。
研究结论
综上，本研究发现M1型和M2型 LAMs计数可以作为一种快速和经济的方法将MCL患者分成不同危险组。MCL患者的M1型LAMs向M2型极化比率明显较低，M型和M2型LAMs数量增多与OS较差有关。然而，M1型和M2型LAMs上PD-L1表达升高可能对MCL预后有不同的影响，仍需进行更大的队列研究及对LAMs进行更深入的评估。
Li P, Yuan J, Ahmed FS, et al. High Counts of CD68+ and CD163+ Macrophages in Mantle Cell Lymphoma Are Associated With Inferior Prognosis. Front Oncol. 2021 Aug 30;11:701492. doi: 10.3389/fonc.2021.701492.
CN-105198
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