由福建省抗癌协会中西医整合肿瘤专委会青年委员会主办的“十邑论坛”开播啦！论坛于每周四推出，带您用中文听原汁原味的美国临床肿瘤学会（ASCO）研究。循环肿瘤DNA（ctDNA）检测已经成为组织检测外的必要替代和补充。ctDNA检测结果的解释受到检测方法、检测技术和患者状况影响，并存在一些缺陷和挑战。第155期十邑论坛对ctDNA检测的基础知识进行概览。
医学博士
福建省抗癌协会癌痛专业委员会副主任委员
福建省抗癌协会肿瘤心理专委会委员兼秘书
福建省抗癌协会中西医整合肿瘤专委会青年委员会副主任委员
中国老年学和老年医学学会精准医疗分会委员
中国老年学和老年医学学会肿瘤康复分会食管癌专家委员会委员
福建省医学会科学普及分会青年委员会委员
福建省肿瘤内科学会青年委员会委员
福建省转化医学实验室主要成员
什么是ctDNA？
1948年首次发现细胞游离DNA（cfDNA），是指血循环中160~200 bp的小DNA片段，由细胞死亡后释放入血。健康成人中的cfDNA主要来源于造血细胞且比例很低，而癌症患者的cfDNA可来自于肿瘤细胞释放，因而被称为ctDNA。ctDNA较cfDNA片段更小，因此可用片段大小区分ctDNA和cfDNA，或在基因测序之外使检测更为准确。ctDNA主要在肝脏清除，半衰期约为2小时，因此可动态追踪肿瘤负荷。
在检测前需要最佳ctDNA片段。目前证据表明血浆比血清更适合检测，血液应收集于含有EDTA抗凝剂的试管中，最好在收集后1~2小时内完成血浆处理以避免白细胞裂解，或使用细胞保存管保存。处理后的样本应保持在-80℃直至DNA提取。ctDNA可检测肿瘤相关改变，如点突变，易位/融合，扩增和缺失，染色体异常，表观修饰/甲基化和DNA片段长度等。
和传统组织学检测相比，ctDNA检测更为方便安全，成本更低；可提供整个肿瘤或转移部位异质性信息，而非来自于单个取样部位；定量信息和肿瘤负荷相关。但是需要特殊处理。
一项研究对一例结肠癌肝转移患者使用ctDNA追踪肿瘤分子异质性，结果显示各个基因变化遵循原发肿瘤的进化轨迹，在治疗过程中，ctDNA可发现特征性改变（图1）。
图1 ctDNA追踪基因变异动态变化
然而并非所有肿瘤均相同。一项研究发现不同类型肿瘤的ctDNA检出率不同，结直肠癌检出率较高，前列腺癌、甲状腺癌等检出率较低。不同肿瘤间和肿瘤内的ctDNA水平不同。影响血液中ctDNA检出的关键因素包括疾病部位，肿瘤负荷，检测时机，疾病状态，细胞类型，变异类型等。
ctDNA检测技术的挑战之一在于ctDNA只占cfDNA的很小一部分。无法提高灵敏度时，低水平突变难以检测或定量。因此在过去10年中，ctDNA的检测技术有了显著进步。
检测方法选择
不同肿瘤的检测目的不同。对于局部肿瘤，检测目的为检测最小残留病（MRD）、复发和进行治疗监测；对于转移性疾病，检测目的为分子分型、治疗监测和发现耐药突变。聚合酶链式反应（PCR）和二代测序（NGS）技术均可用于检测，可进行针对性或全基因组分析。
PCR适用于单个基因或少数基因中反复出现的已知热点突变检测，可提供定量分析，可检测等位基因频率＜0.01%的变异。成本低，流程简单，只需要几个小时。NGS检测可以覆盖更广泛基因组区域，灵敏度高，并可检测染色体重排和拷贝数变化，因此普及性越来越高，是同时检测多个基因和筛选耐药突变最经济有效的方法。全外显子测序（WES）可以全面捕捉基因组变化，但是灵敏度更低，周转时间长（表1）。
表1 ctDNA分析方法
检测时应考虑需要检测的靶点区域，覆盖类型和不同类型的检测极限。检测单个核苷酸变异（SNV）及点突变的能力和检测融合的能力不同，和点突变相比，ctDNA检测融合的灵敏度较低，这些分析应在组织中测试。此外还有微卫星不稳定（MSI）和肿瘤突变负荷（TMB）等。目前研究显示不应仅基于血液TMB选择免疫治疗。
一项研究对比了ctDNA和标准检测用于MSI检测，显示当ctDNA≥0.2%时检测灵敏度高，但是ctDNA＜0.2%时难以检测MSI，无法可靠解释MSI检测结果（图2）。ctDNA和组织MSI检测一致性会因检测方法不同而不同，和免疫组化一致性较差，而和PCR及NGS一致性较好。ctDNA检测整体敏感性为87%，准确性98.4%。因此组织学检测依旧是金标准，但是ctDNA检测也是可行的方法，特别是肿瘤分数较高时。
图2 不同肿瘤分数（ctDNA水平）下的MSI评分
一项研究对比了液体活检和NGS肿瘤组织检测前列腺癌和卵巢癌患者的BRCA1/2变异，发现液体活检对于点突变检测准确性高，而对于重排和拷贝数丢失一致性较差，再次强调了肿瘤分数或等位基因变异频率（VAF）的重要性。
另一项研究对比不同检测方法，发现当VAF为0.5%或1.0%时，检测敏感性和可复制性≥90%。而VAF＜0.1%时，液体检测表现下降。技术因素是主要影响因素，主要是由覆盖深度和背景噪音决定。
目前有两类检测策略，一种是检测血浆中突变，不需要肿瘤组织，但是灵敏性较低，更适合于转移肿瘤中发现耐药突变和进行肿瘤筛查；一种是发现肿瘤组织中的突变后在血浆中进行追踪，灵敏度高，可用于MRD检测和监测复发和治疗反应。
ctDNA检测的挑战和陷阱
ctDNA检测时可能会存在假阴性，也即肿瘤中存在的变异未在血浆中被识别。可能原因主要是血浆中ctDNA水平较低，因此最好在进展期而非治疗期进行检测。报告血浆肿瘤分数有助于区分真阴性和假阴性。此外，灵敏度不足，肿瘤低脱落也是假阴性的原因。
假阳性可能是由于测序错误，或非肿瘤衍生突变如未知意义的造血干细胞克隆（CHIP）导致。CHIP会随着年龄，吸烟和既往抗肿瘤治疗而增加，CHIP和肿瘤驱动基因具有重叠，因此使用全血进行ctDNA测序时可通过和组织样本进行配对排除假阳性。
大家可以自行下载对应幻灯，再配合本音频听，效果更好。
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