肿瘤免疫疗法正在迅速发展并被批准用于治疗晚期OSCC病例。目前，观察到检查点抑制剂的使用从姑息治疗到新辅助治疗的转变可能会改善生存。然而，并非所有患者都对现在应用的免疫检查点抑制剂有反应。因此，还需要研究更多的免疫检查点，使其可用于治疗。然而，有关OSCC的免疫检查点表达的数据很少。近日，Cancers杂志发表了一项德国埃尔兰根-纽伦堡大学的研究[1]，研究旨在通过NanoString mRNA分析，对OSCC中大量的免疫调节剂进行比较分析，以确定可能的治疗应用靶点。研究结果提示，抑制性受体和配体的上调以及激活剂的下调可能导致效应性T细胞功能降低，并可能诱发OSCC的局部免疫抑制。免疫系统激活因子的表达增加可以解释为OSCC组织中髓系细胞和T细胞的浸润增加。
研究背景
口腔鳞状细胞癌（OSCC）是口腔最常见的肿瘤，占90%以上[2]，为第五大最常见的癌症。对高危病例进行手术切除并辅以放射（化疗）治疗，是治疗口腔鳞状细胞癌（OSCC）的有效方法。然而，除了最初的R0切除，复发经常发生，需要进行抢救性手术、再放射或姑息性系统治疗，患者总生存率和生活质量并不令人满意[3]。
抗PD-1免疫疗法改善了一小部分患者长期生存率[4]。然而，现代新辅助免疫治疗对超过半数的患者疗效不明显。这种对ICI的初级抵抗可能是由于肠道微生物组的异常组成。抗生素已被证明会干扰ICIs对晚期癌症患者的临床益处。在用对治疗没有反应的患者的粪便进行粪便微生物群移植后，口服补充A. muciniphila可以增加小鼠肿瘤中PD-1阻断的疗效。另一个提高应答率的策略是将抗PD-1治疗与其他免疫治疗药物相结合，如将PD-1与细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）抑制剂相结合或加入巨噬细胞调节药物[5]。
基于检查点抑制剂的免疫疗法首先使用CTLA-4抑制剂，随后是PD-1抑制剂[6]。然而，后来又出现了各种抑制性和激活性的免疫检查点信号通路，对免疫反应进行精细调节。
然而，尽管已确定的具有免疫检查点功能的细胞受体数量在不断增加，但在OSCC中，目前描述的许多免疫检查点的表达至今还没有得到全面的分析。因此，本研究在mRNA水平上分析了16个免疫学相关的检查点，以及细胞标志物和细胞因子，作为进一步有针对性地研究OSCC中检查点和免疫逃避的基础。
研究方法
纳入 98 例 OSCC 患者（OSCC 组）和 41 名健康志愿者（对照组、正常口腔黏膜、NOM）的福尔马林固定石蜡包埋组织标本。进行NanoString mRNA分析，评估OSCC组织和健康口腔粘膜中21个免疫调节检查点分子的表达水平。比较了两组的表达率，并确定了它们与预后参数的关系。此外，还研究了不同检查点的表达水平之间的相关关系。
图1. nCounter PlexSet 设计和异构体覆盖
研究结果
1. 研究参与者的人口统计学和临床组织病理学特征
健康对照组（NOM）的平均年龄明显低于OSCC组（P = 0.01）。随访期间，25名患者复发（25.5%），62名患者（63.3%）无复发。平均无病生存期（DFS）为12.7个月。（表2）
表2. 研究参与者统计学及组织病理学特征
2. OSCC和NOM之间免疫调节剂表达率比较
CD115（p = 0.0001，FC = 3.02），以及CD68（p = 0.0001，FC = 4.04）和CD163（p = 0.009，FC = 1.8）在OSCC中明显增加。激活性检查点受体CD86（p = 0.03，FC = 1.33）和激活性配体CD28（p = 0.006， FC = 1.75）水平明显增加。抑制性受体CD96（p = 0.02, FC = 1.79）及抑制性配体PD-L1（p = 0.002, FC = 4.07）和GITRL（p = 0.04, FC = 1.58）在恶性肿瘤中明显高表达，但CD96和GITRL的变化量不到2倍。CD137L的表达明显下降（p = 0.02, FC = 1.5）。与NOM相比，细胞毒性T细胞标志物CD8和抑制性受体CTLA4、BTLA和PD-1的表达水平在OSCC中至少增加了两倍（FCCD8 = 2.76，FCCTLA-4 = 1.99， FCBTLA = 2.44，FCPD-1 = 2.2）。（表3、图2）
表3. OSCC中免疫调节剂的差异性表达统计分析
图2. .OSCC组和NOM组之间免疫调节剂表达率比较博弈图
3. 差异性表达模式与临床组织病理学参数的关系
T3/T4肿瘤组中，CD115（p = 0.05； FC = 1.6）、CD68（p = 0.04，FC = 1.3）和CD137L（p = 0.04，FC = 1.7）的表达有弱统计学意义的下调。PD-L1（p = 0.001，FC = 5.7）和IL10（p = 0.009，FC = 1.3）的表达在T3/T4肿瘤组明显降低（表4）。
表4. 特定组别、表达水平的变化（FC）和OSCC组织中差异表达的相关性
分析显示，只有CD68（p =0.05，FC=1.56）在淋巴结转移患者的肿瘤组织中呈小幅相关上调（表4）。在随访期间有复发疾病的患者的肿瘤组织中，CD80明显下调（p = 0.02，FC = 2.2）。Kruskal-Wallis检验显示，分化（分级）与CD115（p = 0.02）、CD68（p = 0.01）、 CD163（p = 0.001）和PD-L1（p = 0.03）的差异性表达有关（表4）。进一步分析显示，除PD- L1外，免疫调节剂的表达随着分化程度的提高而降低。（表5，图3）。
表5. 不同分化程度免疫检查点表达水平的变化
图3. 不同分化程度组间CD115、CD68、CD163和PD-L1表达水平比较
4. 受体、匹配配体和相应的免疫细胞之间的关系
PD-1的表达与PD-L1或PD-L2无关。未观察到TIGIT和CD155的表达相关性，但TIGIT和CD96的表达密切相关（Spearman's ρ = 0.43, p = 0.0001；表S2）。
PD-L1和CD68的表达在OSSC组强相关性（Spearman's ρ = 0.527, p < 0.001）。CD163与PD-L1表达的相关性在所有组别都很明显。然而，与NOM（ρ = 0.483）相比 ，OSCC组的关系更强（ρ = 0.739）：表6，图4）。
表6.CD163和CD68的表达与PD配体的相关性
图4. OSCC和NOM组中PD-L1和CD163的表达呈正相关的显著性
OSCC组未观察到CD86和CD28或CD80之间的弱相关关系。（图5）
图5. CD28/CTLA-4-CD80/86信号通路以及免疫调节剂CD28和CTLA-4与细胞毒性T细胞标志物CD8 的相关性分析
CD8作为细胞毒性T细胞标志物的表达与CD28成正相关（Spearman's ρ = 0.269, p < 0.001），和 CTLA-4成负相关（Spearman's ρ = 0.227, p < 0.007；表7A）。
表7. 标志物表达相关性
5. 与诊断和预后参数有关的拮抗性免疫调节剂CTLA-4/CD28的表达比例的变化
复发患者CTLA-4与CD28的表达比例比率明显更高 （2倍）（p = 0.036；FC = 2.2；NOM：4.85；OSCC： 10.49；图6）。
图6. CTLA-4与CD28的表达比例
6. 免疫调节蛋白的表达与标志物的关系
分析免疫检查点与CD8的比率，发现CD137的水平升高，而TIGIT的表达较少 。（表8a）。
与NOM（1.06）相比，只有PD-L1/CD115的比率在OSCC（3.37）中明显增加，而NOM组的CD137L/CD115和CD155/CD115的比率更高。（表8c）。
与NOM（0.73）相比，OSCC（4.30）的PD-L1/CD68的比率明显增加。（表8c）。
表8.免疫调节蛋白的表达与标志物的关系
研究结论
1. 免疫细胞和细胞因子
与NOM组织相比，OSCC中的细胞毒性T细胞标志物CD8上调了2倍多；然而，它未能达到统计学意义水平。这表明OSCC中的免疫细胞浸润失调与恶性生长有关。但UICC晚期的OSCC患者的CD8表达明显减少，表明晚期口腔癌的T细胞反应可能受损。
在OSCC和NOM组，CD115的表达率与巨噬细胞标记物CD68和CD163密切相关。CD115的激活可以使巨噬细胞极化转向促进肿瘤的M2细胞。在分析中检测到CD115的高表达表明，在口腔癌中以CD115为目标进行巨噬细胞调控是有潜力的。
此外，分析结果还显示与G2和G3病例相比，G1 OSCC的CD115、CD68和CD163表达明显增加。结果表明，即使在组织形态学分级较低的病例中也存在着高度的免疫细胞失调。
2．免疫检查点
PD-L/PD-1信号通路是OSCC免疫治疗的主要目标。本研究显示，OSCC中PD-L1的表达明显上调，而PD-L2配体的表达没有明显增加。
分析还显示，与G2和G3级的肿瘤相比，G1级OSCC病例的PD-L1表达增加。这表明，在组织形态特征的恶性程度较低的病例中，有可能出现高度免疫抑制的微环境。
此外，本研究评估了检查点的表达与巨噬细胞浸润和M2极化的相关性。结果表明浸润的巨噬细胞在肿瘤组织中PD-L1表达增加，如果由CD163的表达决定，则与它们的极化无关。
同时， OSCC 中 CD86 配体的显著上调，及基于活化T细胞的CD28受体明显上调，表明OSCC组织中T细胞激活的潜力增加。
NOM组分析发现CD80和CD86的表达之间高度正相关，但在OSCC中消失，表明OSCC中CD28介导的T细胞共激活可能失调。
在随访期间复发的OSCC病例中，CD80的表达明显下降，可能表明T细胞激活的减少与疾病复发有关。
此外，研究结果也提示与TIGIT相比，CD155-CD96途径可能与OSCC的免疫规避更相关。
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