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对于大多数实体瘤来说，传统活检是诊断癌症和评估分子特征的黄金标准，可以指导治疗决策。活检虽然必要，但其具有侵入性，会造成疼痛，并且本身可能存在风险。医生通常会限制不必要的活检，但又可能因此而遗漏治疗期间或治疗后肿瘤内发生的关键改变。另外，并非所有的组织均可用于活检，并且样品仅来自肿瘤的一部分，可能无法准确代表肿瘤整体的特性。
由于这些原因，研究人员一直致力于研发探测肿瘤的低创方法，比如说监测肿瘤细胞释放到血流中的DNA。研究人员可以对这种DNA进行测序，从而识别肿瘤特有的突变，随后监测患者血液中存在的突变是否增加、减少或变化。
2021年圣安东尼奥乳腺癌研讨会于12月7-10日以线上线下融合形式举行，在其中的一场教育专题会议上，演讲嘉宾概述了研究人员可以怎样利用液体活检技术推进癌症治疗。在一场全体大会上，研究人员还介绍了三项临床试验的数据，这些试验均使用液体活检来监测乳腺癌患者的治疗方法、指导治疗决策。
液体活检的前景和困难
François-Clément Bidard 博士，法国居里研究所和巴黎-萨克雷大学的肿瘤内科教授，在这场教育专题会议上做了开场发言，总结了液体活检技术的一项关键的临床应用面临的相关挑战：如何比影像法更早地检测到转移性复发。
François-Clément Bidard博士
Bidard说：“到目前为止，研究显示循环肿瘤DNA（ctDNA）的检出与实际临床复发之间的领先时间有限。”“即使不是全部，目前大多数ctDNA技术也能检测出正在扩大的转移或微转移。”
领先时间是患者治疗过程中医生可以干预的时机，利用该时机或许可以延迟或防止肿瘤发生临床进展。Bidard说，ctDNA检出得越早，领先时间越长，潜在的效益越好。
他接着用正在进行的临床试验中的例子，描述医生们可以如何利用领先时间来调整患者的治疗方法。两项此类试验包括III期ZEST和II期ASPRIA试验，在这两项试验中，乳腺癌患者如果在临床复发前检测到ctDNA，则改用二线治疗，以期延缓或预防复发。
Bidard还提到了类似的II期PERSEVERE和ARTEMIS试验，这两项试验致力于探索对一线治疗后ctDNA仍呈阳性（通常是即将复发的迹象）的患者的干预措施。在这两项试验中，患者在临床复发之前正在逐步升级到二线治疗。
Bidard说：“我认为在转移尚未产生症状时，ctDNA疾病监测为预后评估以及原发和继发耐药性监测带来了一线新的希望。”
然而，基于血液的活检能捕获到的不仅仅有肿瘤中的DNA。循环肿瘤细胞（CTCs）中也蕴藏着广泛的信息，比如蛋白质、囊泡、代谢产物和RNA片段等。
麻省总医院分子生物学家、哈佛医学院外科教授Shyamala Maheswaran博士说：“CTCs蕴藏着肿瘤细胞内存在的全部分子信息。”“对它们进行分离和表征是一种无创的手段，可以反复快速地监测肿瘤随时间的演变。”
Shyamala Maheswaran 博士
她解释说，CTCs有助于人们了解癌症的进展、转移和对治疗方法的应答情况。CTCs可以在实验室中收获和培养，可以在实验室对其进行全面的表征、基因操作或使用各种药物进行治疗。通过单细胞测序和蛋白质组学可以了解关于细胞信号如何随时间变化的关键信息。比如，单细胞分析可以揭示传统活检无法揭示的肿瘤异质性的细节。
Maheswaran使用了一种方法，利用CTC分析更好地了解肿瘤的演变：即研究患者病程中的上皮-间质转化（EMT，一种可以导致转移的细胞状态转变）过程。她及同事从转移性乳腺癌患者中分离出CTCs，并对其进行了染色，以标记上皮细胞和间质细胞特有的几种RNA。研究人员经常观察到，细胞并不是简单的非此即彼的状态。
“我们观察到，EMT并不代表两种截然不同的状态，而是一个具有多个中间态的连续的过程。”Maheswaran说。
Maheswaran及其同事发现，在疾病进展过程中和对治疗方法的应答中，上皮标记物较多的细胞/间质标记物较多的细胞的比例发生了变化，当治疗方法奏效时，上皮表型增多，当肿瘤获得耐药性时，间质表型增多。他们进一步深入研究了这一过程背后的机制，发现上皮细胞中PI3K信号通路上调与疗效不良有关。
尽管液体活检能够表征此类过程，但仍存在一些挑战限制其临床应用。纪念斯隆-凯特琳癌症中心的肿瘤内科医生Pedram Razavi 博士阐述了其中的一些局限，并为扩展液体活检在临床中的应用提供了一些思路。
Pedram Razavi博士
Razavi说：“液体活检已经在一系列应用中展现了其潜在效用，现在正开始用它们造福患者。”“我们迫切需要设计和开展基于ctDNA的适应性临床试验，以便确定是否可以利用液体活检来改善患者的临床结局。”
血液中ctDNA太少是一个难题，尤其是局部肿瘤或乳腺癌，不会释放太多ctDNA。Razavi说，在疾病早期，整管血液中常常只有不到一个完整拷贝的肿瘤基因组，这妨碍了对肿瘤突变特征的全面评估。
此外，大多数ctDNA特征分析方法都是检测单个基因或一小组基因的突变，这可能会遗漏新突变或意外突变。选取合适的基因进行检测可能是件难事，特别是发生克隆性造血（一种造血干细胞产生具有各种突变的血细胞的良性过程）时，可能产生具有肿瘤样突变特征的循环DNA。
Razavi提出，当与其他技术（如蛋白质组学、甲基化组学和影像学）联合使用时，液体活检的效能可能达到最佳。
他还建议在可能的情况下使用更灵敏的ctDNA评估方法，比如新一代测序。这样就能够检测样本中存在的所有突变，而不是选取的少数突变。此外，由于ctDNA片段比其他形式的循环DNA要短，因此通过测序可以区分肿瘤突变和克隆性造血导致的突变。
在测序不可行的情况下，Razavi建议对多个突变进行特征分析。他指出，在监测复发时，根据原发肿瘤的已知突变设计一个患者特异性的基因组合可能更有益。这种基于肿瘤的或“定制”的检测方法在检测微小残留病方面越来越受欢迎。
Razavi说：“这些检测方法的灵敏度明显优于我们目前用于转移性肿瘤的检测方法。”
评估临床效用
在同天举行的一次全体大会上，少数研究人员用临床试验数据证明了液体活检的前景。
ctDNA的热门应用之一是根据ctDNA的存在量预测患者的预后，无论是在治疗前还是治疗期间。在BioItaLEE试验中，研究人员招募了接受激素疗法（来曲唑，商品名：Femara）加CDK 4/6抑制剂瑞博西尼（商品名Kisqali）一线治疗的乳腺癌患者，以便确定ctDNA水平的变化与对治疗方法的应答之间的相关性情况。
意大利圣拉斐尔科学研究医院乳腺癌组和临床转化与免疫治疗组负责人、医学博士Giampaolo Bianchini说：“本研究的主要目的是识别循环肿瘤DNA的改变，表征它们在治疗过程中如何演变，并评估它们与临床结局之间的可能的相关性。”
Giampaolo Bianchini博士
Bianchini及其同事在治疗开始前采集了263例患者的样本，之后在第一个28天周期的第15天和第二个周期的第1天再次采集。许多患者的突变等位基因频率（VAF，即通过给定的突变检测到的ctDNA的相对量）显著降低，47.1%的患者在第15天时变为ctDNA阴性，52.4%的患者在第29天时变为ctDNA阴性。
研究人员发现，ctDNA的快速清除与预后变好之间有相关性。在第15天时ctDNA变为阴性的患者的中位无疾病进展生存期为21.85个月，而ctDNA仍呈阳性的患者为12.09个月。同样，在第29天时清除了ctDNA的患者的中位无疾病进展生存期为22.11个月，而ctDNA仍呈阳性的患者为12.32个月。
ctDNA水平与预后之间的强相关性表明，ctDNA阳性可以成为预测日后复发的强预测因子。其他研究人员正在致力于研究在患者复发之前，ctDNA能给医生多少先发优势，以及在这段时间内可以做些什么来干预。
Nicholas Turner 博士是伦敦癌症研究所的肿瘤内科医生，也是伦敦托比·罗宾森乳腺癌研究中心的一位组长，他介绍了c-TRAK TN试验的结果，该试验对161名三阴性乳腺癌患者在手术和完成一线化疗后进行ctDNA监测。该研究的目的是确定这些患者ctDNA阳性和明显复发之间的中位时间，这在既往研究中有过回顾性分析，但从未有过前瞻性研究。
Nicholas Turner博士
患者每3个月提供一次血样，持续15至18个月，并检测样本中是否存在原发性肿瘤中发现的患者特异性突变。一旦检测出ctDNA，临床上检测不到转移的患者即被随机分为继续观察组和开始用免疫疗法帕博利珠单抗（商品名：Keytruda）治疗组。
令人惊讶的是，Turner及其同事发现超过70%的ctDNA阳性患者在采集血样时也有明显的转移，这意味着ctDNA检测并没有比其他方法更快地检测到复发。分配至观察组的无临床复发患者的中位无疾病复发生存期为4.1个月，Turner指出，这比大多数回顾性研究中的生存期短得多。
该试验中只有5例患者接受了帕博利珠单抗治疗，其中4例因复发或不良事件而中止治疗。Turner仍然认为该研究证明了三阴性乳腺癌患者ctDNA监测的一些关键点。
Turner说：“我们需要弄清楚提早发现复发能否改善临床结局。”“该研究并不是为了解决这个问题而设计的，但我希望以后的研究能够以此设计。”
Turner强调，在以后的研究中，研究人员应该考虑在复发可能性更大的前六个月内，通过增加分析的突变数和增加检测频率来提高灵敏度。此外，他认为ctDNA检测可能对侵袭性、“高危”疾病患者的益处较小。
Turner说：“55%的高危患者在12个月内变成ctDNA阳性。”“因此，仅仅是高危这一点就可能足以指导该患者群体的进一步治疗。”
然而，对于侵袭性较小的疾病类型患者，领先时间可能为医生干预患者治疗争取到足够的机会。Bidard报告的III期PADA-1试验监测了因激素阳性乳腺癌而接受治疗的患者是否发生ESR1（编码雌激素受体α的基因）突变。肿瘤常常通过ESR1突变产生对抗雌激素药物的耐药性，这时就需要换用不同的治疗方法。Bidard及其同事力求确定液体活检能否更早地发现这些突变，以及干预是否可以改善生存期。
“PADA-1的概念相当新颖。”Bidard说。“这不是一项严格意义上的一线研究，也不是疾病进展后的二线研究。这是一线治疗期间的药物转换研究。”
该试验招募了1017名接受一种芳香化酶抑制剂+CDK 4/6抑制剂帕布昔利布（商品名：Ibrance）治疗的患者，这些患者在基线时无ESR1突变，并同意每两个月进行一次ctDNA筛查。如果在筛查期间检测到ESR1突变，则临床上未检测到复发的患者被随机分为继续现有疗法组和改用氟维司群（商品名：Faslodex）+帕布昔利布组。
被分到改用药物组的88例患者的中位无疾病进展生存期为11.9个月，是被分到继续接受芳香化酶抑制剂+帕布昔利布疗法组的84例患者的两倍多。
后一队列的患者一旦发生疾病进展可以改变方案，但改变方案的患者的无疾病进展生存期仅为3.5个月。Bidard说，这表明在临床复发前进行干预明显比等待复发发生有更好的临床结局。
Bidard说：“我们相信，这种临床效益也许证明了实施PADA-1治疗策略是常规治疗中的有效选项。”“我们也相信，监测耐药相关突变的增加情况可以为癌症治疗带来一线新的希望。”
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