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Cancer Cell | 张泽民/丁培荣/朱琳楠/程斯进/高千千合作揭示了直肠癌新辅助治疗期间T细胞和内皮细胞的重塑机制

11月25日

来源：Scientific Services和元生物

新辅助治疗（TNT）是局部晚期直肠癌（LARC）的标准治疗方案，但其疗效背后的免疫重塑机制尚不明确。

2025年11月6日，重庆医科大学/北京大学张泽民、中山大学丁培荣、北京大学朱琳楠、重庆医科大学程斯进、高千千等合作在 Cancer Cell（IF=44.5）发表题为Remodeling of T and endothelial cells during total neoadjuvant therapy in rectal cancer的研究成果。

使用scRNA-seq、scTCR-seq和空间转录组测序，表征了不同新辅助治疗诱导的肿瘤微环境(TME)变化。TNT与调节性T细胞减少和高IFNG表达的IFNG+CD8+效应记忆T细胞增加相关，可能有助于提高完全缓解率。肿瘤浸润性CD8 + T细胞丰度与TNT后ACKR1+内皮细胞亚群的富集相关。进一步证实，内皮细胞在受到可能由CD8 + T细胞释放的IFNγ刺激时，获得了增强的呈递抗原和激活CD8 + T细胞的能力。

总之，该研究揭示了TNT后活化的CD8+ T细胞和内皮细胞之间独特的相互作用。

研究结果

1.新辅助治疗后局部晚期直肠癌的细胞类型分布

纳入了26例接受新辅助化疗（nCT）和新辅助治疗（TNT）的局部晚期直肠癌（LARC）患者（图1A）。基于影像学评估，nCT治疗患者的SD为62%，PR为38%；而TNT治疗患者的疗效更佳，PR为73%， CR为27%（图1B -1D）。基于病理和临床评估，nCT治疗组无患者达到CR，而TNT治疗组有64%的患者达到CR（图1E）。

为了探索治疗机制，对92个样本（包括44个血液和48个肿瘤组织）进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）和scTCR-seq，大多数是治疗前和治疗后的配对样本（图1A）。经过严格的质控，获得了619,635个高质量细胞，包括PBMC 的372,929个细胞和肿瘤组织的246,706个细胞。鉴定到了19种主要细胞类型（图1F ）和85个亚群。

图1接受不同新辅助治疗的局部晚期直肠癌患者

新辅助治疗后，恶性细胞数量减少，尤其是TNT治疗后（图2A和2B）。免疫细胞的动态变化则较为复杂。尽管肿瘤微环境（TME）中单核细胞数量较低（图2A），但nRT和TNT治疗后，单核细胞和巨噬细胞的数量均增加（图2B）。在TME中，nRT治疗后CD8 + T细胞比例下降，而TNT治疗后CD8 + T细胞比例保持稳定（图2A、2B），提示化疗可能促进CD8 + T细胞流入或返回局部TME，或者可能是由放射引起的延迟性炎症所致。尽管nRT后CD4 + T细胞频率基本保持不变（图2B），但Treg细胞数量增加（图2C）。进一步分析显示，nRT后Treg升高，但在TNT组中，Treg频率下降，尤其是CD4 - Treg - TNFRSF9亚群（图2D）。

利用scTCR-seq分析了新辅助治疗中expanded Treg clonotypes。两种主要的Treg细胞簇，CD4-Treg-TNFRSF9和CD4-Treg-KLRB1，在nRT后扩增，但在nCT和TNT后减少（图2E），表明放疗后引起的Treg克隆扩增可能在后续化疗后有所缓解。此外，nRT后 CD8/Treg 比值（尤其是 CD8/CD4-Treg-TNFRSF9）降低，而TNT后升高（图 2F）。综上所述，不同的新辅助治疗方案会显著重塑LARC 的肿瘤微环境，其中 TNT 治疗后显示出更高的 CD8/Treg 比值。

图2 LARC肿瘤微环境中细胞类型的组成受不同新辅助疗法的调控

2.新辅助疗法重塑局部晚期直肠癌的肿瘤微环境

接下来分析了不同细胞亚群的异质性。治疗前富集了增殖性T细胞簇，包括CD4-T-MKI67、CD8-T-MKI67、exhausted CD8-Tex-CXCL13等（图3A）。nCT和nRT治疗后表现出不同的细胞亚群分布，而TNT治疗兼具两者特征，并展现出独特性（图3A）。这些结果表明，新辅助治疗显著改变了TME的细胞组成，尤其是细胞亚群组成。

为了更好地探究治疗后TME亚群的多细胞协同，进行了细胞模块（cellular module, CM）分析。鉴定到了7个独特的CM（CM1-CM7），如CM2表现出效应和促炎细胞的特征，而CM3则与TLS相关（图3B）。在nCT中TLS相关的CM3模块富集，与效应和促炎相关的CM2模块则减少（图3C-D）。空间转录组、HE染色、免疫荧光（mIF）等进一步支持了nCT后TLS的富集（图3E-I）。TNT后CM1、CM2和CM7表现出动态变化，值得注意的是，CM2的升高与更好的生存率相关（图3D）。这些结果表明，不同的新辅助治疗方案重塑了LARC肿瘤微环境。

图3 新辅助疗法重塑了LARC肿瘤微环境

3. IFNG + CD8 + Tem细胞比例和IFNG信号通路特征可预测LARC患者的TNT疗效

鉴于CD8 + T细胞在抗肿瘤免疫过程中的关键作用，作者重点关注了富集于M2模块的CD8 + T细胞亚群。CD8-Tem-IFNG (IFNG + CD8 + Tem)亚群在nRT后下降，但TNT后上升（图4A），尤其在CR患者中（图4B）。IFNG + CD8 + Tem细胞高表达IFNG、CD69、GZMH、GZMK和HLA-DRA等（图4C），提示其在抗肿瘤免疫中发挥作用。RNA 速度分析显示，IFNG + CD8 + Tem 细胞可能起源于 CD8-Tem-CXCR4，并分化为exhausted CD8-Tex-CXCL13。转录因子分析显示，IFNG + CD8 + Tem细胞亚群中TF 调控子（包括JUN、JUNB和FOS ）被激活（图 4D），且JUN、JUNB和FOS与IFNG呈显著正相关性关系（图 4E ），表明 AP-1 家族在调控IFNG表达中起着关键作用。

正如预期，TNT治疗后CD8 + T细胞中IFNG的表达显著升高，且IFNG的高表达仅在TNT治疗后的CR患者中观察到，表明IFNG可能是一个LARC临床疗效的生物标志物。与此一致的是，mIF染色显示TNT治疗后IFNγ + CD8 + T细胞数量增加，尤其是在CR患者中（图4 F-I）。

除了重塑TME外，新辅助治疗似乎还影响全身免疫，新辅助治疗后PBMC中的IFNG信号通路活性升高，尤其是CR患者（图4K-L ）。PBMC的bulk RNA-seq也证实了这一趋势（图4M-N ）。ROC分析表明，IFNG特征可以区分新辅助治疗后的CR患者和非CR患者（图4O）。

图4 TNT 治疗后 IFNG + CD8 + Tem 细胞组成和IFNG信号特征

4.肿瘤浸润性 IFNG + CD8 + Tem 细胞可能由 EC 从 PBL 募集而来

进一步分析了4例患者在治疗前、nRT和TNT治疗后IFNG + CD8 + Tem细胞的动态变化。nRT后其频率降低，但TNT后又回升至更高水平（图5A），这与CD8 + T细胞的变化趋势一致（图5B）。由于新辅助放化疗抑制了整体细胞增殖，因此TNT后IFNG + CD8 + Tem细胞的增加可能反映了外周血淋巴细胞（PBL）的募集。进一步探究了IFNG + CD8 + Tem细胞的TCR克隆情况。TNT后PBMC CD8 + T cells 和IFNG + CD8 + Tem cells细胞的TCR克隆数量显著增加（图5C）。nRT后PBMC TCR克隆数量减少，而TNT后则升高（图5D ），这可能是由于辐射诱导的淋巴细胞耗竭所致。

鉴于内皮细胞 (EC) 在 T 细胞募集过程中发挥的关键作用，进一步探究了新辅助治疗后 EC 的动态变化。nRT后 EC 比例呈上升趋势，TNT 后进一步升高（图 5E），尤其是在CR患者中。mIF 证实了TNT 后CD31 + ECs细胞数的升高（图 5F）。此外， EC细胞动态变化与IFNG + CD8 + Tem细胞一致（图4A和4B），且二者呈正相关（图5G ）。为了进一步探究EC募集IFNG + CD8 + Tem细胞的潜力，分析了EC细胞亚群。在三个EC亚群中（图5H），ACKR1 + ECs簇富集了与黏附和募集相关的基因，包括ACKR1、SELP、 SELE、IL33和MADCAM1（图5I）。受体-配体分析表明，ACKR1 + ECs与IFNG + CD8 + Tem细胞的相互作用最强（图 5J）。与此一致的是，TNT治疗后ACKR1 + ECs的频率升高，而 nCT 或 nRT则未见升高（图 5K）。ACKR1 + ECs与IFNG + CD8 + Tem的细胞比例呈正相关（图 5L）。这些分析表明，ACKR1 + EC 具有较高的 T 细胞募集潜力。

空间转录组证实了 ACKR1 + ECs与活化CD8+ T 细胞（以GZMH和CD69表达为标志）的共定位（图 5M和4C）。mIF显示，TNT 处理后ACKR1 + CD31 + ECs细胞密度增加（图 5N），且更多 IFNγ + CD8 + T细胞位于 ACKR1 + CD31 + ECs细胞附近（图 5O和 5P），表明相互作用增强。此外，TNT 处理后 ACKR1 + CD31 + ECs细胞与IFNγ + CD8 + T细胞之间的距离缩短（图 5Q），且 IFNγ + CD8 + T细胞位于ACKR1 + CD31 + ECs 细胞的20 μm 范围内（图 5R）。综上所述，ECs（尤其是 ACKR1 + ECs）在募集 CD8 + T 细胞方面可能发挥关键作用。

图5 肿瘤浸润性 IFNG + CD8 + Tem 细胞可能主要由 ACKR1 + EC从 PBL 募集而来

5.CD8 + T细胞和内皮细胞之间潜在的相互调节

进一步对TNT中的内皮细胞进行了功能表征。除了细胞黏附相关通路外，抗原呈递和T细胞活化通路在TNT治疗后的内皮细胞中显著富集（图6A ），MHC-I和MHC-II基因表达显著增加（图6B和6C），尤其在CR患者中（图6D和6E）。此外，EC中的MHC-I和MHC-II基因（图6F）及IFNG信号通路（图6G）与CD8 + T细胞中IFNG的表达呈正相关，且TNT处理后EC中IFNG信号通路特征（图6H）和IFNGR1表达（图6I）均升高，且二者呈正相关（图6J ），提示IFNG-IFNGR1轴可能在CD8 + T细胞与EC的相互作用中发挥作用。

在共培养体系中，IFNγ刺激的HUVEC激活了CD8 + T细胞，诱导了IFNγ、CD69、GZMB和HLA-DR的显著表达，但其激活能力弱于巨噬细胞（图6K和6L）。在没有抗原或IFNγ刺激的情况下，HUVEC无法激活CD8 + T细胞（图6K和6L）。与此一致的是，与CytoStim共培养的CD8 + T细胞IFNγ的分泌达到峰值（图6M）。随后研究了IFNγ刺激的SVEC4-10细胞是否能够激活CD8 + T细胞。IFNγ刺激的SVEC4-10细胞诱导CD8 + T细胞中IFNγ、CD69、GZMB和穿孔素的表达水平升高，但略低于骨髓来源巨噬细胞（BMDM）（图6N）。此外，抗原特异性激活标志物CTLA-4和PD-1的表达也增强（图6O ）。这些结果表明，IFNγ刺激的SVEC4-10细胞可以作为抗原呈递细胞（APC）以抗原特异性方式激活CD8 + T细胞。

图6 IFNγ刺激的内皮细胞在TNT处理后激活CD8 + T细胞

原文链接
https://www.cell.com/cancer-cell/fulltext/S1535-6108(25)00449-0

责任编辑：肿瘤资讯-Skye
排版编辑：肿瘤资讯-as

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