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Nat Commun | 武汉大学团队突破技术瓶颈：新型测序法解密胃癌细胞外囊泡DNA全基因组甲基化，为癌症早筛提供新视角

09月03日

来源：转化医学网

8月29日，武汉大学团队在《自然·通讯》（Nature Communications）发表重磅论文，提出一种名为“Tn5辅助酶促甲基测序联合转化加尾”（TEMPT）的新型全基因组甲基化测序技术，成功破解了胃癌患者血液中微量细胞外囊泡DNA（EV-DNA）的甲基化密码。这项突破不仅填补了低输入量EV-DNA甲基化分析的技术空白，更揭示了EV-DNA在癌症发生发展中的关键作用，为胃癌早期诊断和肿瘤微环境研究提供了全新视角。

TEMPT技术用于细胞外囊泡DNA样本深度甲基化测序的概述

技术瓶颈：为何EV-DNA甲基化测序难？

癌症的早期诊断是全球医学领域的重大挑战。传统的组织活检因侵入性强、难以动态监测，逐渐被“液体活检”替代——通过分析血液中的循环肿瘤DNA（ctDNA）或细胞外囊泡（EVs）等生物标志物，实现无创或微创的疾病检测。 然而，ctDNA存在半衰期短（仅5~150分钟）、片段化严重等问题，限制了其大规模应用。 相比之下，EVs是细胞分泌的纳米级“小包裹”，内含蛋白质、核酸（如DNA、RNA）和脂质，在血液中稳定性高，且能反映母细胞的分子特征，被视为“液体活检的新星”。

但EV-DNA的检测同样困难重重：

含量极低：临床血浆中EV-DNA浓度仅为0.07~1.67 ng/mL（约为游离DNA的1/20）；

长度较长：EV-DNA多为160~180 bp以上的大片段，传统测序前的文库构建需高效片段化；

甲基化测序技术限制：主流的亚硫酸氢盐测序需数百纳克DNA输入，且易导致DNA损伤；其他无亚硫酸氢盐方法虽减少损伤，但对低输入量样本仍不够高效。

EV-DNA就像藏在血液里的“加密信”，但信太少、纸太脆，传统方法根本读不懂。 研究团队的目标就是开发一把“万能钥匙”，既能高效提取信的内容，又不破坏关键信息。

技术突破：TEMPT如何破解EV-DNA甲基化密码？

TEMPT技术评估概述

针对上述挑战，研究团队开发了TEMPT技术，其核心创新在于“三步走”策略：

单适配器Tn5标签化：传统Tn5转座酶需在DNA两端插入不同适配器（效率仅约50%），TEMPT通过改造Tn5，使其携带单一端适配器，确保切割后的DNA片段均带同一适配器，大幅提升文库构建效率；
2.酶促转化替代亚硫酸氢盐：采用温和的酶促反应（TET氧化+β-葡萄糖基转移酶保护修饰碱基+APOBEC脱氨），避免亚硫酸氢盐对DNA的损伤，同时实现99.73%的未修饰胞嘧啶转化率（仅0.27%未转化）；
3.3’端加尾连接适配器：通过末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）给DNA片段3’端添加多聚C尾，再用带多聚G尾的适配器连接，彻底解决“双适配器连接效率低”的难题。
实验数据显示，TEMPT对超低输入量EV-DNA（低至亚纳克级）的文库构建效率比传统方法（如SALP、s3）高30%以上，且覆盖均匀性、甲基化转换准确性（非转化率仅1.27%）均达到测序要求。

TEMPT稳健区分胃癌与良性病例并识别潜在标志物

关键发现：EV-DNA甲基化揭示癌症“通讯密码”

EV-DNA甲基化谱揭示了癌症患者中的细胞迁移与通讯特征

借助TEMPT技术，研究团队分析了58例胃癌患者（含早期、晚期）及胃息肉（良性对照）的EV-DNA样本，获得了以下突破性发现：

差异甲基化区域（DMRs）可作为癌症“分子标签”
通过对比癌症与良性样本，研究团队鉴定出647个癌症相关DMRs（差异甲基化区域）。这些区域在基因组中主要富集于增强子等调控元件，提示EV-DNA的甲基化异常可能通过调控基因表达参与癌症发生。
基于这些DMRs构建的机器学习模型，在发现队列中区分癌症与良性的准确率（AUC）达0.81，验证队列中仍保持0.80，显示出可靠的诊断潜力。这意味着未来仅需抽取少量血液，就能通过EV-DNA的甲基化特征快速筛查胃癌。
2. EV-DNA甲基化与癌症进展密切相关
进一步分析早期（Tis-T1）与晚期（T2-T4）癌症样本的DMRs，发现阶段特异性DMRs更多富集于启动子、增强子和CTCF结合位点，且晚期样本中多数DMRs呈低甲基化趋势。低甲基化通常与基因激活相关，提示这些区域的基因可能在癌症进展中被“唤醒”，驱动肿瘤侵袭和转移。
3. 免疫细胞是EV-DNA的“重要信使”
此前研究认为，EV-DNA主要来源于肿瘤细胞死亡或主动分泌，但本研究通过“组织去卷积”分析发现，免疫细胞（如巨噬细胞、浆细胞）是EV-DNA的重要来源之一。与良性样本相比，癌症患者的EV-DNA中，巨噬细胞贡献度增加2.3倍，浆细胞增加2.8倍（虽未达统计学显著性，但趋势明确）。
这意味着EV不仅是肿瘤细胞的“传声筒”，更是免疫细胞与肿瘤“对话”的载体。研究软对发现的DMRs关联基因YES1（Src家族激酶，参与信号传递）、FN1（细胞粘附）等，均与免疫细胞功能密切相关。未来或可通过分析EV-DNA的甲基化特征，监测肿瘤免疫微环境的变化。

临床意义与未来展望

这项研究不仅为胃癌早期诊断提供了新的生物标志物（EV-DNA甲基化DMRs），更揭示了EV在肿瘤微环境中的“通讯”功能，为理解癌症转移机制提供了新视角。

目前，研究团队正与医院合作，计划扩大样本量（尤其是早期癌症患者），验证TEMPT的临床实用性，并探索EV-DNA甲基化与患者预后、治疗响应的关联。此外，团队还在优化TEMPT技术，尝试整合染色质共沉淀（ChIP）技术，同步分析EV-DNA的组蛋白修饰，进一步挖掘其表观遗传信息。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-025-63435-w

责任编辑：肿瘤资讯-QTT
排版编辑：肿瘤资讯-AS

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09月04日

蒋从飞

响水县人民医院 | 肿瘤科

内容精彩，很有帮助。

09月03日

舒颖

广东省人民医院赣州医院 | 肿瘤内科

差异甲基化区域（DMRs）可作为癌症“分子标签”

09月03日

何作华

嘉鱼县人民医院 | 呼吸内科

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