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西达本胺诱导EB病毒（EBV）裂解感染，并与替诺福韦协同作用消除EBV阳性伯基特淋巴瘤

10月29日

作者：徐林艳张猛桑威

单位：徐州医科大学血研所，徐州医科大学附属医院血液科淋巴瘤中心

来源：J Pharmacol Exp Ther. 2023 Dec;387(3):288-298.

作者简介

桑威

医学博士，副教授，主任医师，博士生导师

徐医附院细胞研究和转化医学中心副主任
徐医附院血液科科副主任,淋巴瘤病区主任
中华医学会血液学分会淋巴细胞疾病学组委员
中国抗癌协会淋巴瘤专委会委员
中国EBV相关疾病工作组秘书长
中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会青年委员
中国抗癌协会血液肿瘤委员会慢淋工作组委员
中国抗癌协会第一届T细胞淋巴瘤工作组委员
中国老年医学会血液学分会淋巴瘤学组委员
江苏省医学会血液学分会青年委员会副主任委员
江苏省淋巴瘤联盟副主席
江苏省医学会血液学分会淋巴瘤学组委员
江苏省“六大人才高峰”“333”人才培养对象
江苏省“科教强卫工程”青年医学人才
国家自然科学基金评审专家

徐林艳

徐州医科大学第一临床学院血液内科

张猛

徐州医科大学第一临床学院血液内科2020级硕士研究生

研究背景

EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)是一种人类c-疱疹病毒，其再激活在EBV驱动的伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma, BL)的发展中起着重要作用。尽管强化化疗，复发/难治性BL患者的预后仍然不利，并且缺乏完全消除潜伏EBV感染的明确方法。先前的研究表明，组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂可以诱导EBV从潜伏期过渡到裂解期。替诺福韦是一种有效的DNA复制抑制剂，可以抑制EBV的裂解激活。

研究目的

本研究旨在探讨HDAC抑制剂西达本胺对EBV裂解感染的影响。此外，我们将探讨西达本胺联合替诺福韦联合治疗EBV阳性BL的抗肿瘤效果，并评估其对EBV相关裂解基因的影响。

研究方法

在本研究中，我们用新型HDAC抑制剂西达本胺处理BL细胞，然后测定细胞活力、细胞周期、细胞凋亡和特异性细胞信号通路。比较单药抑制和西达本胺与替诺福韦联合处理Burkitt淋巴瘤细胞的作用。采用Raji细胞荷瘤NSG小鼠模型，分析西达本胺和替诺福韦联合使用以分析其肿瘤抑制作用。

结果

西达本胺抑制BL细胞增殖，阻滞细胞周期进程。在Raji、Namalwa和CA46细胞系中，西达本胺下调mRNA水平并以浓度依赖性的方式上调组蛋白H3乙酰化表达。在菊胺处理的BL细胞中，G1期细胞比例较高，S期细胞比例较低，而G2/M期细胞比例无明显变化(图1、A和B)。此外，western blotting显示，BL细胞中p21和p27表达呈浓度依赖性上调，Cyclin D1和Cyclin E1表达下调(图1C)。

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图1 西达本胺阻滞人类BL细胞的细胞周期进程

西达本胺诱导BL细胞凋亡并激活凋亡通路。如图2、A和B所示，西达本胺处理诱导Raji、Namalwa和CA46细胞呈浓度依赖性凋亡。Western blotting分析显示，在菊胺处理的BL细胞中，Caspase3和PARP的表达上调(图2C)。此外，凋亡通路研究显示，在奇达酰胺处理的BL细胞中，DR5和Caspase8的裂解形式上调(图2C)，表明奇达酰胺激活了外源性凋亡通路。同时，西达本胺以浓度依赖的方式上调促凋亡蛋白Bax，下调抗凋亡蛋白Mcl-1和XIAP的表达，提示西达本胺诱导内源性凋亡通路激活(图2D)。

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图2 西达本胺诱导人BL细胞凋亡并激活凋亡通路

Chidamide与替诺福韦291协同作用于ASPET用SP600125预处理细胞(图3、E和F)，提示child胺诱导BL细胞凋亡的方式依赖于MAPK通路。

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图3 西达本胺调节人BL细胞中c-Myc的表达和MAPK通路

为了评估西达本胺对EBV基因的影响，我们用不同浓度的西达本胺处理EBV阳性的Raji和Namalwa细胞48小时。如图4，A和B，经child amide处理后，潜伏基因(EBNA1和RPMS1) mRNA水平呈浓度依赖性降低。相比之下，在西达本胺处理后，裂解病毒转录物如BZLF1、BMRF1和BMLF1的表达水平显著升高(图4、D和E)。

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图4 西达本胺促进EBV阳性BL细胞中EBV裂解基因的表达

替诺福韦增强西达本胺对EBV阳性BL细胞的抗增殖作用。用递增浓度的西达本胺和替诺福韦孵育BL细胞48小时，计算各联合用药组的生长抑制比如图5、A、c所示。在EBV阳性的Raji和Namalwa细胞中，联合用药组的细胞抑制比高于单药组，而在EBV阴性的CA46细胞中，联合用药组的细胞抑制比高于单药组。这表明这些药物联合使用比单独使用任何一种药物对EBV阳性BL细胞的毒性更大。利用CompuSyn软件计算西达本胺和替诺福韦的CI值。

在Raji和Namalwa细胞中，在所有测试浓度下，CI值始终小于1，但在CA46细胞中则不如此(图5,B和C)。这些结果表明，与替诺福韦联合使用可增强西达本胺对EBV阳性BL细胞的抗增殖作用。

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图5 替诺福韦增强西达本胺对EBV阳性BL细胞的抗增殖作用

西达本胺和替诺福韦联合用药对Raji、Namalwa和CA46细胞的凋亡反应。有趣的是，替诺福韦的加入显著增强了西达本胺诱导的细胞凋亡，在Raji和Namalwa细胞中产生了协同促凋亡作用(图6,a和B)。相反，在EBV阴性的CA46细胞中没有观察到协同作用(图6,a和B)。Western blot分析显示，在西达本胺和替诺福韦的作用下，Caspase9、Caspase3、PARP和促凋亡蛋白Bax的裂解水平均显著上调。同时，抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(图6C)。此外，western blot分析显示，在Raji和Namalwa细胞中，西达本胺和替诺福韦联合使用显著提高了p-JNK和p-P38的水平，而降低了p-ERK的水平(图6D)。

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图6 替诺福韦与西达本胺协同，通过调节MAPK通路诱导EBV阳性BL细胞凋亡

替诺福韦阻断西达本胺诱导的EBV阳性BL细胞裂解基因转录。进一步实验检测替诺福韦对西达本胺诱导的裂解基因转录的影响。图7显示，替诺福韦的加入显著抑制了西达本胺诱导的EBV裂解基因(BZLF1、BMRF1和BMLF1)和TK的转录。

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图7 替诺福韦阻断西达本胺诱导的EBV阳性BL细胞的裂解基因转录

替诺福韦与西达本胺协同增强小鼠BL细胞荷瘤模型的抑瘤作用为了研究西达本胺联合替诺福韦的体内抗肿瘤作用，本研究采用Raji细胞荷瘤NSG小鼠模型。作为单一药物，替诺福韦不足以诱导肿瘤缓解，但单独使用西达本胺显示部分抗肿瘤活性。引人注目的是，加入替诺福韦后，西达本胺诱导的肿瘤抑制作用显著增强，体现在肿瘤发光明显减少，肿瘤大小、重量和体积也明显减小(图8,a - f)。进一步病理检查显示，对照组和替诺福韦组肿瘤组织以肿瘤细胞为主，仅有少量坏死细胞，而西达本胺组肿瘤移植物肿瘤组织结构部分受损，有部分坏死肿瘤细胞(图8G)。尤其在西达本胺加替诺福韦组，肿瘤抑制作用增强，肿瘤组织结构严重受损，并伴有大量坏死细胞(图8G)。western blot检测肿瘤组织中凋亡通路和MAPK通路。与体外研究一致，我们的体内研究显示，与单药组相比，西达本胺加替诺福韦组Caspase9、Caspase3、PARP的裂解水平和Bax的表达上调，而抗凋亡蛋白Mcl-1明显下调(图8H)。同时，在EBV阳性的BL细胞荷瘤小鼠中西达本胺和替诺福韦联合用药可显著提高p-JNK和p-P38水平，降低p-ERK水平(图8I)。

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图8 替诺福韦与西达本胺协同作用，增强了BL细胞荷瘤小鼠模型的肿瘤抑制作用

上述研究结果证实了西达本胺联合替诺福韦在EBV阳性BL细胞中诱导生长抑制和凋亡的协同作用，并为消除EBV及EBV相关恶性肿瘤提供了有效的策略。

高水平的EB病毒(EBV) DNA一直与EBV相关淋巴瘤的不利无进展生存期和总生存期相关。因此，寻找有效根除肿瘤细胞和消除EBV的新策略对淋巴瘤患者至关重要。本研究首次证实了西达本胺联合替诺福韦治疗伯基特淋巴瘤和根除EBV病毒的协同作用。