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【阔然开朗】多重荧光免疫组化技术，病理新未来

2023年08月25日

来源：肿瘤资讯

人类对癌症的生物学和治疗管理的理解已经有了深刻的进展，发现了与肿瘤生物学、分类、预后和治疗相关的新的生物标志物。这在免疫肿瘤学领域尤为明显，免疫疗法已经极大地改善了许多晚期癌症患者的预后。然而，在常规临床实践中，组织病理学诊断和预后仍然主要依赖于血红蛋白和嗜酸性染色的切片，通过色素免疫组化（IHC）的顺序评估单个生物标志物。虽然这种方法相对容易实施，但在有限的活检组织中浪费组织，同时评估多个标志物存在困难，并且不适合进行定量和空间分析。因此，在精准医学时代，必须考虑在解剖病理学中寻找新的工具来研究组织。

当前技术的局限性

当前在大多数临床实验室中使用的组织染色方法包括单一染色的免疫组化（IHC）、双重染色的免疫组化和单一染色的免疫荧光（IF）。

单一染色的免疫组化是通过抗体检测单个靶标，并使用单一颜色在亮场显微镜下进行评估。这种染色免疫组化方法可以直接使用（将针对目标的一抗直接与酶结合，如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶）或间接使用（将一抗与特定物种的二抗结合，二抗与酶结合）。在实践中通常由病理学家进行半定量人工判读，存在观察者间的差异性。线性动态范围较窄，不适合评估潜在生物表达的全动态范围。此外，需要对特定细胞群进行表型分型的情况下存在局限性。
双重染色的免疫组化可以同时检测两个目标，但当目标抗原重叠在同一细胞区域时，确定是否存在双重标记可能会有困难。双染需要使用不同种属的一抗，以避免与二抗发生交叉反应，在抗体选择上存在一定的限制。此外，双重染色的免疫组化的成本会比对两个靶标进行单染的高。
单一染色的免疫荧光可以提供与免疫组化相当的数据，并具有更大的动态信号范围。但是，免疫荧光对于固定在石蜡中的组织来说并不是最佳选择，且荧光信号随着时间和光照的增加而逐渐消失，不适合长时间后的可靠复查。

总体而言，单一染色的免疫组化适用于低复杂度的情况，而荧光平台则提供了高复杂度的选项。多重染色的免疫组化和免疫荧光技术可以克服单一染色方法的局限性，但也存在一些技术和成本方面的挑战。

IHC和mIHC的技术原理图

多重荧光免疫组化（mIHC）

多重荧光免疫组化（mIHC）技术是一种用于同时检测多个标记物的技术。它通过使用不同的荧光染料标记不同的抗体，可以在一张片子上同时检测多个细胞标记物或蛋白质标记物，提供更详细的信息，包括细胞类型、个数、密度和空间位置关系等信息。mIHC可以通过将多个不同的抗体与不同的荧光染料结合来实现。每个抗体都可以特异性地与目标标记物结合，并且每个荧光染料都有自己特定的发射光谱。通过使用荧光显微镜，可以同时检测和定位多个标记物。mIHC技术既存在显著的优势又存在巨大的挑战：

优势：

同时评估多个生物标志物：mIHC可以在同一组织切片上同时检测多个生物标志物，提供更全面的信息。
高灵敏度和特异性：荧光信号可以在低浓度下被检测到，并且具有较低的背景信号，提供高灵敏度和特异性。
空间分析：mIHC可以提供细胞和组织中不同标志物的空间分布信息，有助于了解细胞亚群的相互作用和组织结构。
定量分析：通过数字图像分析，可以对mIHC的结果进行定量分析，提供更准确和客观的数据。
多通道成像：mIHC可以使用多个荧光通道同时检测多个标志物，提供更多的信息。

挑战：

光谱重叠：不同荧光染料之间可能存在光谱重叠的问题，需要高精度的仪器和图像处理算法进行光谱分离和校正，以减少信号的交叉干扰。
技术挑战：mIHC需要对多个抗体进行优化和验证，同时需要进行复杂的实验操作和图像分析。
样本处理：mIHC需要对组织切片进行特殊的处理和染色步骤，可能需要更多的时间和努力。
成本和设备：mIHC需要使用多种荧光染料和高精度的扫描设备，可能增加实验成本和设备要求。

mIHC的临床应用

mIHC在临床应用中具有广泛的潜力，可以用于诊断、预后评估和指导治疗等方面。

肿瘤免疫治疗预测：可以评估肿瘤微环境中多个免疫相关标志物的表达，帮助预测肿瘤对免疫治疗的响应。通过检测PD-1、PD-L1、CD8、CD2、CD23等标志物的表达情况，可以考察肿瘤微环境浸润类型，三级淋巴结构（TLS）的分布状态，从而预测免疫检查点抑制剂治疗的疗效。
肿瘤亚型鉴定：可以同时评估多个肿瘤标志物的表达，帮助鉴定肿瘤的亚型，这对于指导个体化治疗和预后评估非常重要。
临床试验和伴随诊断测试：可以用于临床试验和伴随诊断测试，帮助筛选适合特定治疗的患者。通过评估多个标志物的表达情况，可以更准确地选择患者，并预测治疗的疗效。
疾病诊断和分型：可以用于疾病的早期诊断和分型。通过同时检测多个生物标志物，可以提供更全面和准确的诊断信息，有助于指导治疗决策。
药物研发和药物靶点鉴定：多重检测可以用于药物研发和药物靶点鉴定。通过评估多个标志物的表达和相互作用，可以帮助确定药物的作用机制和靶点，从而指导药物研发过程。

未来，临床对mIHC的需求将会是由诊断和预后两方面的需求驱动形成。诊断性mIHC可以帮助病理学家更高效地对肿瘤进行分类。预后性mIHC，包括免疫分型，可能是由临床需求驱动的，并可能以FDA批准的伴随测试的形式出现。预后性mIHC已在肿瘤分型中广泛研究，以预测免疫治疗的反应。其中，PD-1、PD-L1、CD8、FoxP3、CD68（或CD163）、肿瘤标志物的6色panel和TLS相关panel已经进行了临床验证和可重复性研究，因此有望进入临床应用。因此，未来的互补诊断测试或伴随诊断测试有很大可能会基于mIHC来实现。

临床应用的挑战

mIHC在临床应用中仍处于早期阶段，需要进一步的研究和验证，也面临一些挑战。

技术要求：需要专门的设备和技术，包括多光谱扫描仪和荧光显微镜。这些设备的购买和维护成本较高，对于许多临床实验室来说可能是一个挑战。
标记物选择：需要选择多个标记物来同时评估。选择适当的标记物组合是一个复杂的任务，需要考虑标记物的互补性、特异性和灵敏度。
标准化和验证：mIHC的标准化和验证是一个复杂的过程。不同实验室之间的方法和结果的一致性可能存在差异，确保mIHC的准确性和可靠性需要制定一致的标准和验证程序。
数据分析和解释：mIHC生成的数据量庞大，需要进行复杂的数据分析和解释，这需要专门的软件和算法来处理和解释多重荧光图像数据。
临床实用性和经济效益：尽管mIHC在研究中显示出潜在的临床应用，但其临床实用性和经济效益还需充分验证。mIHC的临床效果和其对患者管理的影响也需要进一步的研究和验证。

总的来说，mIHC在临床使用中面临着技术、标准化、数据分析和经济等多个方面的挑战。克服这些障碍需要进一步的研究和努力，以确保mIHC的准确性、可靠性和临床实用性。

总结

多重荧光免疫组化技术在病理和临床都具有巨大潜力，包括在小生物检查中进行复杂的免疫表型分析，以及提高化疗、靶向、免疫等疗法反应的预测能力。随着病理学的自动化和数字化的增加，mIHC即将进入临床领域，为病理学家提供有价值且多功能的研究工具。

针对mIHC面临的技术和临床应用的挑战，阔然生物推出了下一代病理的整体解决方案：通过Kreep多重荧光免疫组化染色技术、Krast全自动免疫组化染色机、KR-HT5多光谱成像扫描技术和KRIAS定量病理图像分析技术，可对肿瘤微环境中的各类细胞进行表型鉴别和统计分析，更加精准地筛选肿瘤药物适用人群，为生物标志物在疾病发生发展中的功能提供更有价值的信息，进而实现了病理医生对直接影响疗效的肿瘤微环境做出专业的病理诊断。

参考文献

1. Harms PW, Frankel TL, Moutafi M, Rao A, Rimm DL, Taube JM, Thomas D, Chan MP, Pantanowitz L. Multiplex Immunohistochemistry and Immunofluorescence: A Practical Update for Pathologists. Mod Pathol. 2023 Jul;36(7):100197. doi: 10.1016/j.modpat.2023.100197.

排版编辑：肿瘤资讯-lynn

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