吉林大学第一医院 肿瘤科
吉林大学2013级临床医学八年制，肿瘤学博士。
获得国家留学基金委资助前往加拿大曼尼托巴大学癌症研究所学习。
目前共发表sci文章4篇，其中第一作者2篇，累计总影响因子19.016分，发表中文核心杂志2篇，参与国自然面上项目2项，参与《寻根白求恩》、《老年肿瘤学》、《肿瘤生态学》、《肿瘤免疫营养》等书籍教辅的编写。
主要研究方向为“恶性黑色素瘤转移与细胞焦亡”。
研究背景
PACIFIC疗法是III期不可切除的非小细胞肺癌（NSCLC）患者的标准治疗方案，以根治性同步放化疗（dCCRT）后接受度伐利尤单抗（durvalumab）巩固治疗的模式将患者5年OS从15%提高到42.9%[1, 2]。然而，大约一半的患者在治疗后1年内会经历疾病进展，而目前对该疗法导致耐药的机制知之甚少，如何更精准地去规范诊疗还需要不断地深入挖掘线索。对于ICI治疗的耐药机制已经在IV期NSCLC中进行了很好的研究。肿瘤细胞较低的PD-L1表达水平、淋巴细胞浸润较少或者低水平的肿瘤突变负荷(TMB)都代表着较低的抗原呈递水平，间接影响了T细胞识别肿瘤细胞的能力。这些经典的生物标志物是否适用于接受PACIFIC方案的III期NSCLC患者目前尚不明确。此外，PACIFIC方案中dCCRT所诱导的免疫原性细胞死亡（ICD）与PD-L1抑制剂durvalumab具有协同效应，而近年来发现，肿瘤细胞会通过一系列手段来抵抗这种协同效应，包括表达TIM3分子负性调控T细胞抗肿瘤免疫[3]、表达CD39/CD73促进腺苷生成抑制免疫活化[4]，以及表达CD47分子释放出“别吃我”的信号[5]……这其中哪一个因素占据主导作用目前不得而知。因此，本研究通过对135位接受PACIFIC方案的NSCLC患者治疗前后的肿瘤组织标本对比分析，通过免疫组化（IHC）、基因表达谱分析（GEP）和全外显子组测序（WES）等技术探索接受dCCRT治疗后的患者对durvalumab巩固治疗产生耐药的机制，以求找到优化治疗的指导线索和生物标志物（图1）。
图1 患者入组和样本采集流程图
研究结果
结果1:肿瘤TME中预先存在的适应性免疫对治疗获益极其重要，肿瘤细胞表达CD73分子可能是对PACIFIC方案的抵抗机制
作者发现，接受PACIFIC治疗前肿瘤组织PD-L1表达低、TMB水平低以及CD8+TIL浸润低的患者与较差的PFS相关，表明一旦患者的初始免疫原性较低，即使在接受了提高免疫原性的dCCRT刺激后也会发生对PD-L1阻断治疗的原发性耐药（图2A-C）。此外，肿瘤细胞高表达CD73分子与更短的PFS显著相关（图2D），通过分析这种CD73的表达差异是否与免疫微环境存在关联，作者发现在CD8+TIL浸润高的患者中，CD73分子表达水平与疾病进展的关联更为明显，而在浸润低的患者中没有观察到关联（图2E）。此外，通过多变量分析发现，癌细胞的CD8+TIL浸润密度低和肿瘤细胞高表达CD73分子在PACIFIC治疗期间与疾病早期进展独立且密切相关（图2F）。
图2 III期NSCLC患者TME谱与接受PACIFIC治疗后PFS的相关性。
为了进一步分析患者发生耐药的TME谱，作者对接受PACIFIC治疗前的肿瘤组织进行GEP检测，发现CD8+TIL的浸润水平与免疫蛋白酶体、抗原提呈和T细胞活性等基因的表达水平显著相关（图3A），并且，在CD8+TIL高水平浸润的TME中，抗原提呈、IFN、JAK-STAT信号通路呈现出高水平的活化状态和较强的炎症特征（图3B-C），这些数据表明，通过IHC评估的CD8+TIL密度可以代表肿瘤中由T细胞活性和抗原提呈水平所代表的适应性免疫应答水平。
接下来作者通过对高CD8+TIL浸润的这部分人群进行差异基因表达分析，发现NT5E基因（编码CD73）高表达的人群不能持续受益（Non-DCB），PFS<1年，表示CD73分子对于PD-L1治疗抵抗的重要性（图3D-E）。不仅如此，CD73高表达的肿瘤组织中，与肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）、内皮细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）相关的基因也都高表达，血管生成、髓系细胞活化、TGF-β通路都呈现出活跃的状态（图3F-G）。这些数据与临床前研究一致，CD73可以通过促进腺苷的产生招募CAFs和TAMs进入TME，并促进肿瘤血管的生成[6]。
图3 III期非小细胞肺癌dCCRT后durvalumab耐药的转录表型分析
小结：肿瘤部位预先存在有效的适应性免疫是PACIFIC方案可行的先决条件，CD8+TIL的浸润密度代表了对ICI治疗有效的免疫原性标志。尽管dCCRT会增加癌细胞的免疫原性，但该文章数据显示，没有预先存在高水平的CD8+TIL的肿瘤对PACIFIC方案产生持久反应的可能性要小得多。这种免疫原性差的肿瘤需要开发其他策略来支持ICI疗法。CD73分子的表达提供了不利的TME，抵消了CD8+TIL浸润所赋予的免疫活性，逃避了反应性CD8+TIL的杀伤，削弱了durvalumab依靠这种适应性免疫对肿瘤的抑制作用。值得注意的是，本篇文章检测的是dCCRT之前的CD73表达水平，并不是ICD所诱导的结果，表明该肿瘤自身即存在对durvalumab治疗的抵抗性。
结果2:接受durvalumab治疗后通过监测循环中Ki-67+CD8+T细胞可以预测疾病早期进展
作者分析了接受durvalumab治疗前后患者外周血PBMC的变化，发现在durvalumab治疗前CD8+T细胞多为效应记忆细胞（EM）和终末分化效应记忆细胞（EMRA），并且这群效应细胞呈现出Ki67表达增加的趋势，这表明患者在经历dCCRT后，体内的CD8+T细胞呈现出近期暴露于目标抗原的状态（图4A-B）。同时，患者在接受durvalumab治疗后，CD8+T细胞的Ki-67表达会降低，表明机体在接受单抗治疗后抗原负担减少（图4C）。此外，作者发现这些Ki-67+的CD8+T细胞处于CD39、PD-1、TIM-3高表达的疲软受抑表型（图4D），可能是由于持续暴露于循环肿瘤细胞的残留抗原所致，也因此，这种Ki-67+或者疲软表型的CD8+T细胞在Non-DCB患者中更常见（图4E-F）。与这一观点一致的是，CD73高表达的患者在接受durvalumab单抗治疗后，循环中Ki-67+CD8+T细胞持续存在（图4G）。
图4 III期NSCLC患者dCCRT后接受durvalumab治疗与循环CD8+T细胞流式表型的关系
小结：通过对durvalumab治疗后循环中Ki-67+或疲软表型的CD8+T细胞进行监测，可以预测PACIFIC治疗期间的疾病早期进展。以往IV期NSCLC患者的研究发现，单纯接受PD-1阻断治疗后的循环Ki-67+PD-1+CD8+T细胞反应性增多[7]，然而本研究却发现相反的结果，ICI治疗后循环Ki-67+CD8+T细胞的比例大大减少（图4C），这可能是由于本研究中收集患者PBMC之前的放疗增加了T细胞暴露于抗原的几率，使得外周血中出现异常高频率的Ki-67+CD8+T细胞。当开始durvalumab治疗后，循环Ki-67+CD8+T细胞的比例会下落回先前未接受过抗原刺激的类似于IV期NSCLC患者中观察到的水平，但是如果这些反应性T细胞比例下降的不足，预示着患者体内残留的癌细胞还在持续刺激着CD8+T细胞Ki-67的表达，而这样一种ICI治疗后循环癌细胞持续残留、CD8+T细胞处于疲软受抑的状态预示着疾病终会进展。
结果3:抗原表位的丢失可能是患者ICI获得性耐药的原因
作者对接受PACIFIC治疗前后的10对肿瘤组织标本进行了对比分析（图5A），其中大多数患者一年内即出现疾病进展，故可被认为原发性耐药（Non-DCB），他们其中的大多数在PACIFIC治疗前肿瘤细胞为CD73高表达或者CD8+T细胞低浸润表型，其中4个复发病例（1，3，4，10）表现为高CD73表达和高CD8+TIL浸润，表明CD73分子的表达并不能阻止CD8+T细胞的浸润，而是抵消了这些浸润T细胞的免疫攻击。
病例5在疾病进展前已有长期的控制，提示这种疾病进展是获得性耐药的结果。该患者肿瘤细胞初始CD73水平较低，并且在治疗前TMB在10例患者中排名第二，因此，尽管肿瘤细胞上未检测到PD-L1的表达，但其在PACIFIC治疗前就具有了较高的免疫原性，保证了ICI治疗的成功。除此之外，该患者即使在发生获得性耐药之后，TMB值仍然很高。为了探索是否是由于治疗过程中免疫原性的丢失从而逃脱了durvalumab的免疫攻击，作者对该患者进行了配对WES检测。结果显示肿瘤在接受durvalumab治疗后新增了9个、丢失了2个非同义突变（图5B），然而，这些突变并非致病性变异，与免疫和蛋白功能也无关，因此它们不太可能是获得性耐药的原因。接下来，作者预测了肿瘤细胞的新抗原，在四种蛋白质变体中发现了可能被适应性免疫靶向的7个表位（图5C)。其中，VWA8 p.R165H的两个表位在疾病进展时明显丢失，表明在PACIFIC方案治疗期间，肿瘤可能通过失去这种具有免疫原性新抗原的亚克隆群体来适应免疫压力。同时，5个潜在的新表位在疾病进展中高频出现，很有可能是治疗这种耐药肿瘤的可行靶点。
图5 接受PACIFIC治疗方案后发生疾病进展的TME谱
小结：迄今为止，即使是在IV期NSCLC的研究中，并没有太多的研究来评估ICI长期治疗后的获得性耐药机制，少量研究认为可能与抗原表位的呈递受损有关[8]。本研究通过对实现长期控制的患者发生获得性耐药前后的肿瘤组织测序对比发现，免疫原性表位的丢失可能导致了对PACIFIC方案的耐药，表明即使在之前接受过dCCRT的III期NSCLC患者中也可能存在类似的机制。抗原表位的丢失代表了肿瘤免疫原性的根本改变，因此不再适合依赖于TME中预先存在的T细胞进行治疗，而免疫原性新表位的出现也预示着后续可以靶向这些表位进行适应性细胞治疗。尽管目前对患者ICI耐药后的肿瘤组织进行采集具有挑战性，但从这篇研究结果来看，ICI治疗后重新评估肿瘤组织的免疫原性对接下来治疗的指导具有重要意义。
笔者解读
研究意义
自首次报告PACIFIC疗法生存获益已经过去了五年多的时间，尽管总生存率显著提升，但受益患者的人群特征和耐药患者的进展机制目前尚未有过系统的研究。仅靠检测PD-L1表达水平目前已经不能满足ICI的用药指导，需要挖掘出更加精准、更加有效、更加便捷的生物标志物，才能筛选出真正受益的精准人群。随着检测技术的不断发展，如研究中使用的WES对肿瘤患者抗原新表位的预测，以及利用液体活检动态、便捷地检测患者外周血PBMC的特征变化，等等手段都可以实现对治疗期间疾病进展的特征剖析，对新表位、新抗原、新靶点的探索发现，以及为耐药患者接下来治疗方案指明方向。
研究设计
本研究不仅从肿瘤角度，发现CD73分子的表达、抗原的丢失、抗原提呈的改变都会影响肿瘤细胞的免疫应答，还从TME角度探索了CD8+TIL浸润程度、特征基因的表达对疗效的影响，并且还跨越到外周血角度检测了PBMC的特征，从多个维度多个角度入手，利用多种检测技术对耐药机制进行了探讨分析。尤其是创新性纳入了外周血检测，不仅实时反应了患者在接受durvalumab治疗之前的状态，还为动态监测患者状态提供了一种便捷的检测方式。
然而本研究也有几处不足之处，首先，肿瘤组织标本获取时间为接受dCCRT之前，无法代表患者接受ICI治疗时的实时特征，对于dCCRT期间TME发生的变化也无法知晓。并且最新研究发现，CD8+T细胞可能在遇到肿瘤抗原后的几个小时便发生了耗竭[9]，CD8+TIL的浸润水平高可能只是代表免疫能力的一过性激活，接受dCCRT之前的肿瘤标本能否代表患者接受durvalumab时的免疫活化水平仍值得商榷。此外，该研究对肿瘤组织TME的免疫特征检测采用了IHC的方法，若能使用多色荧光分析的方法可能会更好的反映出免疫细胞的空间特征。并且，本研究在疾病进展后仅收集到10个肿瘤组织标本，是否具有代表性仍然需要验证。
对未来治疗策略的思考
ICI治疗是TME不断衍进、肿瘤不断适应性改变的过程，因此，对于III期NSCLC患者来说，不仅需要在接受PACIFIC治疗前进行样本检测，预测PACIFIC的疗效，还应在治疗期间动态监测特征性指标的变化，才能尽早调整患者的治疗方案。选择的监测手段也十分重要，标本获取的时间、方式、技术都会影响结果的判读。
该研究认为TME中适应性免疫的活化对于患者的长期持续获益十分重要，那么，改善T细胞的受抑状态，例如联合TIGIT单抗可能可以解决ICI维持时间短和患者耐药的问题。此外，该研究发现CD73分子可能是患者发生耐药的机制，目前CD73单抗治疗多种恶性肿瘤的临床试验正在如火如荼地进行中，因此，这一发现不仅可以筛选出对PACIFIC治疗受益的患者，也可以指导后续CD73单抗的临床治疗。
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