目前，中医药治疗恶性肿瘤的作用机制尚存诸多未解之谜，随着现代药理学研究技术的进步，越来越多的临床医生开始尝试通过科学技术手段来探索中医药的真相。网络药理学研究方法，就是常用的中药作用分析手段之一。
【良医汇中医肿瘤资讯】摘录了中国中医科学院广安门医院李铮博士的一篇研究，供临床医生拓展科研思路，为恶性肿瘤的诊治提供一些参考。
肺癌是起源于支气管上皮细胞的原位癌，目前仍然是全球引起癌症相关死亡的主要病因[1-2］。临床治疗以手术、化疗、放疗、靶向治疗等综合治疗为主。但晚期非小细胞肺癌中位生存时间为8~10个月[3］，小细胞肺癌中位生存期为11个月[4］。近年来，生物治疗逐渐兴起，尤其免疫治疗程序性死亡受体-1/程序性死亡-配体1（PD-1/PD-L1）抑制剂为肺癌提供新的治疗手段。中医药在降低肺癌复发转移、减轻放化疗及靶向治疗副反应、改善患者生存质量方面也发挥积极作用。
中医认为，肺癌为正气内虚、邪毒外侵，内生痰湿、瘀血、气滞、毒邪等因素综合作用形成。其中，正气虚损为主要内因。治疗以扶正祛邪为根本大法。人参-黄芪为临床常用补气扶正抗癌之对药。王莉新等[5］通过数据挖掘以及关联算法分析中医治疗肺癌方药，人参与黄芪作为药对频数是46，居中医治疗肺癌药对频数第5位。人参有大补元气、化生津液之功，《名医别录》记载: 调中，止消渴，通血脉，破坚积。黄芪为补药之长，具托毒生肌之效，《神农本草经》: “主痈疽，久败疮，排脓止痛，补虚。”现代研究表明，人参Rg3可诱导人肺癌A549 细胞凋亡[6］，二醇组人参皂苷Rh2抑制Lewis 细胞增殖[7］。黄芪多糖可抑制Lewis 肺癌血管内皮生长因子（VEGF） 表达、提高内皮抑素（Endostatin） 蛋白表达[8］，黄芪水提物显著抑制小鼠肺部肿瘤数量及体积[9］。关于人参、黄芪单味药的药理药效研究较多，但关于人参-黄芪作为对药联合应用药效机制的报道较少。
本文通过网络药理学研究方法，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络，探索人参-黄芪药物活性成分、潜在治疗靶点和作用机制，阐述人参-黄芪治疗肺癌的科学内涵，为进一步实验验证人参-黄芪作用机制提供新靶点和新思路。
1 材料与方法
1.1 筛选人参-黄芪有效成分及靶基因
传统中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP） 是基于传统中草药系统药理学框架而建立的数据库和可视化平台，包括在中国药典中注册的499种中草药，29 384种成分，3 311种作用靶点和837种相关疾病[10］。通过TCMSP进行人参和黄芪活性成分及靶基因筛选。分别检索关键词“人参”“黄芪”，选择“Ingredients”，再根据口服生物利用度（OB）＞30%和类药性（DL）＞0.18 进行筛选，得到人参、黄芪生物活性成分。选择“Ｒelated Targets”，获取人参和黄芪所有活性成分对应的靶基因。
1.2 获取肺癌相关基因
人类基因数据库（GeneCards，https://www.genecards.org）是一个自动整合网络资源的基因数据，全面提供所有有关人类基因注释和预测信息[11］。输入关键词“Lung Cancer”，获得肺癌相关基因。将人参、黄芪靶基因与肺癌相关基因映射，得到人参、黄芪治疗肺癌的靶基因。
1.3 构建“药物-成分-靶点-疾病”网络
将人参、黄芪治疗肺癌的靶基因与OB＞30%和DL＞0.18筛选出的人参、黄芪活性成分映射，建立活性成分与靶基因对应关系，得到治疗肺癌的活性成分以及关键靶基因。Cytoscape是一个开源软件平台，可将复杂网络可视化并且可与任何属性数据进行整合。创建“药物-成分”“成分-靶点”“疾病-靶点”关系文件以及属性文件，导入到Cytoscape（Version 3.7.1）构建“药物-成分-靶点-疾病”网络。在网络中，节点（node）代表人参和黄芪、生物活性成分、关键靶基因以及肺癌。边（edge）代表人参、黄芪与对应活性成分、活性成分与靶基因、肺癌与靶基因相互作用关系。
1.4 构建蛋白-蛋白相互作用（PPI） 网络
STRING（Version 11.0，https://string-db.org） 是整合已知和预测的蛋白质-蛋白质相互作用数据库，而且有可视化展示蛋白质-蛋白质相互作用网络功[12］。选择“multiple proteins”，输入关键靶基因，选择“Homosapiens”进行检索。选择中等置信度为0.400，下载蛋白质-蛋白质文件中蛋白-蛋相互作用tsv文件。将tsv文件导入到Cytoscape，使用插件CentiScape 计算度中心性（DC） ，筛选得到PPI网络核心基因。
1.5 关键靶基因基因本体（GO）及京都基因与基因组百科全书（KEGG）分析
在R软件（Version3.5.2）安装Bioconductor软件包“org．Hs．eg．db”并运行，将人参-黄芪治疗肺癌的关键靶基因转换成entrezID。然后在Ｒ软件安装“clusterProfiler”包，根据已转换的entrezID，以P＜0.05，Q＜0.05 进行关键靶基因GO与KEGG功能富集分析，并将结果以条形图和气泡图形式输出。
2. 结果
2.1 人参-黄芪活性成分和靶基因
在TCMSP数据库检索关键词“人参”“黄芪”分别获得190个和87个活性成分。然后以OB＞30%和DL＞0.18进行筛选，分别筛出22个人参和20个黄芪活性成分。选择“Ingredients”，获得748个人参，953个黄芪所有活性成分对应的靶基因。
2.2 肺癌相关基因
在GeneCards数据库检索“Lung Cancer”，共筛选出21 646个肺癌相关基因，然后分别与748个人参，953个黄芪对应的靶基因映射，得到50个人参，95个黄芪活性成分治疗肺癌的靶基因，见图1。
2.3 “药物-成分-靶点-疾病”网络
将50个人参，95个黄芪治疗肺癌的靶基因分别与22个人参，20个黄芪活性成分进行映射，建立人参、黄芪活性成分与靶基因对应关系，得到与治疗肺癌相关的17个人参和16个黄芪活性成分，见表1，以及与之对应的50个靶基因和95个靶基因，将两者合并后去重，筛出101个关键靶基因。将人参、黄芪与对应活性成分，活性成分与关键靶基因，关键靶基因与肺癌对应关系以及属性导入到Cytoscape，建立“药物-成分-靶点-疾病”网络，见图2。使用CentiScape计算活性成分DC。一个节点DC越大，说明节点在网络中越重要。Quercetin（槲皮素） 为78，kaempferol（山柰酚）为70，isorhamnetin（异鼠李素） 为18，7-O-methylisomucronulatol为17，beta-sitosterol（β-谷甾醇） 为16，位于前5位。
2.4 PPI 网络构建
将关键靶基因输入到STRING，选择中等置信度0.400，下载PPI tsv文件导入到Cytoscape，得到96个PPI网络的基因。用CentiScape计算出DC均值为17.8，以＞17. 8进行筛选，得到38个核心基因，其中白细胞介素-6 （IL-6） DC值为57，血管内皮生长因子A（VEGFA）为52，半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）为52，丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）为51，表皮生长因子受体（EGFR）为49，位于前5位，见图3。前5位核心基因与人参-黄芪活性成分对应关系，见图4。
2.5 GO功能富集分析
通过关键靶基因，共富集121个生物学过程和功能，根据校正后P进行排序，选择前20个进行条形图展示，见图5。人参-黄芪主要参与核受体功能、转录因子活性，类固醇激素受体活性、脱氧核糖核酸（DNA） 结合转录激活因子活性和核糖核酸（RNA）聚合酶Ⅱ特异性，RNA聚合酶Ⅱ近端启动子序列特异性DNA结合，固醇类激素结合，RNA聚合酶Ⅱ转录因子结合、近端启动子DNA结合转录激活因子活性、泛素样蛋白连接酶结合、细胞凋亡、热休克蛋白90（Hsp90）蛋白结合、激活转录因子结合、神经递质受体活性、乙酰胆碱受体活性、神经递质结合，G蛋白偶联胺受体活性，核激素受体结合、谷胱甘肽结合、激素结合等。
2.6 KEGG通路富集分析
关键靶基因与KEGG通路进行映射，共富集133条通路，根据校正后P进行排序，选择前20个进行气泡图展示，见图6。人参-黄芪治疗肺癌的信号通路包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt），细胞凋亡、肿瘤坏死因子（TNF），p53，肿瘤蛋白多糖等信号通路，还包括前列腺癌、肝细胞癌、结直肠癌、胰腺癌、膀胱癌等其他肿瘤相关信号通路。
3 讨论
中医认为，肺癌的发生因正气先虚，无力抗邪，所谓“正气存内，邪不可干”，加之患者经手术、放化疗等治疗后，更伤正气，因此人参-黄芪补虚扶正抗癌切中肯綮。在本研究中，人参-黄芪主要活性成分包括槲皮素，山柰酚，异鼠李素，7-O-methylisomucronulatol，β-谷甾醇等。有研究表明，槲皮素通过Stat3通路抑制肺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭[13］，促进人非小细胞肺癌获得性耐药细胞株PC9细胞凋亡[14］。山柰酚可诱导人小细胞肺癌H446细胞周期阻滞和细胞凋亡[15］，通过抑制雌激素受体相关受体α（ERRα）降低A549细胞侵袭和迁移，抑制上皮间质转化（EMT）[16］。异鼠李素可通过抑制Akt ser473位点磷酸化抑制PC9细胞增殖[17］。β-谷甾醇可诱导A549细胞周期阻滞于G2/M期和细胞凋亡[18］。7-O-methylisomucronulatol 是黄芪特有活性成分，目前鲜有相关研究。在“药物-成分-靶点-疾病”网络中，7-O-methylisomucronulatol与过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARG），雄激素受体（AR）等靶基因相关联，PPAR被作为是治疗肺癌潜在靶点[19］，AR阳性表达可能与淋巴结转移和肺癌进展相关[20］。因此推测7-O-methylisomucronulatol可能有抗肺癌作用，值得进一步实验研究。通过构建关键靶基因PPI网络，得到PPI网络核心基因，其中IL-6，VEGFA，Caspase-3，MAPK8，EGFR基因位于核心位置。IL-6基因编码IL-6蛋白，有研究认为，血清IL-6水平与非小细胞肺癌分期具有相关性[21］。VEGFA基因编码VEGF蛋白，VEGF与非小细胞肺癌局部转移以及预后相关[22］。
CASP3基因编码Caspase-3蛋白，可促进细胞凋亡，在肺癌患者组织Caspase-3表达明显减弱[23］。MAPK8基因编码MAPK8蛋白，又名c-Jun氨基末端激酶1（JNK1），可以调控细胞凋亡和自噬，激活JNK1/2可抑制非小细胞肺癌发生发展[24］。EGFR是公认与肺癌发生密切的基因之一，表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）已广泛应用于EGFR突变非小细胞肺癌治疗。核心基因的GO功能富集主要集中在核受体功能，转录因子活性、聚合酶Ⅱ近RNA端启动子等转录调控相关功能，泛素化蛋白降解相关功能，细胞凋亡功能等。这些基本生物学过程和功能体现在人参-黄芪活性成分调节对应靶基因和具体通路过程中。关于KEGG通路富集，主要包括PI3K/Akt，细胞凋亡，TNF，p53等信号通路。许多肿瘤包括肺癌，PI3K/Akt通路处于激活状态，激活下游信号抑制细胞凋亡，获得性抵抗EGFR-TKIs的治疗[25］。TNF-α通过激活TNF信号通路促进肺癌细胞侵袭和转移[26］。p53是公认抑癌基因，p53信号通路激活可抑制A549细胞增殖[27］，促进A549细胞凋亡[28］。
网络药理学基于已有中药活性成分数据库，可能存在尚未发现或鉴定的人参、黄芪活性成分。已如前述，人参皂苷Rg3，黄芪多糖已证实具有抗肺癌作用，但两者未见于“药物-成分-靶点-疾病”网络中，说明网络药理学分析结果不够全面。基于网络药理学分析得到的活性成分与靶基因具有相关性，但不能明确活性成分对靶基因调控关系。一部分中药活性成分与靶基因相互作用是通过计算机模拟得出，仍需实验加以验证。
综上所述，基于网络药理学研究方法，通过构建“药物-成分-靶点-疾病”网络，从多成分、多靶点、多通路阐释人参-黄芪作为对药治疗肺癌的作用机制，发现活性成分7-O-methylisomucronulatol，为后续深入研究提供一定参考。
（参考文献：略）
排版编辑：云初
苏公网安备 32059002004080号
