砒霜入药在我国有悠久历史，40多年前，三氧化二砷（ATO）成为我国自主发明、世界首创治疗急性早幼粒细胞白血病（APL）的特效药物，直至现在，也依然是治疗APL的最常见一线药物之一。本期【中医肿瘤资讯】为读者带了一项发表于国际期刊Nature Nanotechnology上的研究，旨在提升ATO治疗效果并扩展适应证，研究人员利用CD71配体铁蛋白作为药物载体的创新策略，针对ATO实现靶向递送，显著提高ATO治疗白血病的疗效，进一步降低其毒副作用，并拓展了白血病的使用类型。
论文ID
题目：Ferritin-based targeted delivery of arsenic to diverse leukaemia types confers strong anti-leukaemia therapeutic effects
译名：铁蛋白为基础的砷靶向给药不同类型的白血病具有很强的疗效
期刊：Nature Nanotechnology
IF：40.523
发表时间：2021.10.25
通讯作者单位：南方医科大学珠江医院血液科、中国科学院过程工程所生化工程国家重点实验室
DOI：https://doi.org/10.1038/s41565-021-00980-7
研究背景
白血病一直严重威胁着人类的健康。由于其复杂的致病机制和特征，白血病主要根据病程（急性白血病与慢性白血病）和白血病细胞的来源（髓细胞白血病与淋巴细胞白血病）分为多种类型。到目前为止，化疗仍然是临床主要治疗方式。
在这些化疗药物中，三氧化二砷（ATO）是一种一线抗肿瘤药，用于治疗急性早幼粒细胞白血病（APL），这是急性髓细胞白血病（AML）的亚型。作为药用形式，三价砷（AsIII）主要可以通过诱导细胞凋亡来产生抗白血病作用。然而，ATO在临床配方中是一种离子制剂（ATO注射液），在体内会被迅速清除。这种脱靶效应总是会损害治疗指数，并引发有毒副作用。更严重的是，AsIII在其他类型白血病细胞中的吸收效率低，限制了对其他白血病类型的应用。这些困境凸显了迫切需要制定新战略，以使AsIII有效地作用于不同类型的白血病。
研究人员发现，来自不同白血病类型和疗程的患者的白血病细胞经常具有CD71的强烈表达。作为CD71配体，通过铁介导的协调过程的帮助，使用具有独特四元结构、内腔和热稳定性的铁蛋白来容纳AsIII。由此产生的As@Fn特异性地结合到几种具有高亲和力的白血病细胞，从而显著改善了AsIII的摄取率，并大大增强了细胞毒性。研究人员在细胞系衍生的异种移植（CDX）模型和患者衍生的异种移植（PDX）模型上，系统地验证了这种特洛伊木马策略，比ATO和其他化疗联合治疗表现出更优异的抗白血病功效。
CD71在患者白血病细胞上的表达
鉴于快速增殖的白血病细胞对铁的需求，并考虑到实体肿瘤中已知的CD71水平升高，研究人员假设白血病细胞可能具有CD71的表达升高。因此，研究人员从健康捐赠者的外周血（PB）样本和从白血病患者身上收集的骨髓（BM）样本中筛选了细胞的CD71表达水平（图1a），并对167例白血病患者的临床材料进行全面分析，研究结果证实了该假设，即白血病细胞具有稳定的CD71表达。这一发现还支持了CD71被用作开发治疗白血病新型精准疗法新靶点的可能性。
图1. CD71在不同类型和病程的白血病患者中的高表达
As@Fn的构建和体外评价
研究人员进一步设计了一种含有CD71配体的铁蛋白载体，并考虑到ATO的尺寸非常小，设想有可能将AsIII加载至孔径非常小的apoferritin（不含铁芯的铁蛋白）的独特笼腔（~8纳米）中。此外，鉴于铁蛋白已知对铁离子具有天然吸收性，对高温具有良好的耐受性，研究人员进一步预计，在apoferritin笼内进行高温治疗以形成Fe-O-As纳米复合物是合理的，这应该有助于在白血病细胞特异性释放之前保留高细胞毒性的AsIII离子（详见图2）。
图2. As@Fn纳米药物的制备及特异性受体介导的体外摄取、有效释放和细胞毒性概况
研究结果显示，As的吸收和释放的活性形式显著增强了对HL-60细胞的细胞毒性，As@Fn的半抑制浓度（IC50）值比ATO低4.9倍（图2l）。
上述关于HL-60细胞的研究促使研究人员将研究扩展到多种白血病细胞系，包括ATO敏感（NB4：APL）和非敏感（K562：CML；Nalm6：ALL；RPMI8402：ALL；THP-1：AML；Jurkat：ALL；MOLT-4：ALL；U937：AML）细胞类型。流式细胞仪显示，这些细胞系之间的CD71表达水平各不相同（图3a），从K562的98.1%到U937的9.38%。根据研究人员的预期，As@Fn与白血病细胞系的结合能力以相对较高的CD71表达水平的持续趋势增加（图3b）。这一趋势在As@Fn的内吞作用能力（图3c）和细胞毒性（图3d）中也很明显。值得注意的是，各种白血病细胞系的三个因素（CD71表达水平、摄取率和IC50倍数下降）中的任何一个都密切相关（图3e），这表明使用CD71表达水平作为预测As@Fn临床治疗结果的指标是可行的。此外，CD71在CD71表达低的细胞系上过度表达导致As@Fn的细胞摄取和细胞毒性大大增强（补充图18），再次支持CD71直接参与细胞摄取和细胞毒性。
图3. As@Fn应用于8种不同类型的白血病细胞系和临床样本的特异性结合和细胞毒性评估
在证明了As@Fn对许多类型的白血病细胞的适用性后，研究人员进一步探索了其对临床样本的潜在效用，这些样本在临床上更具相关性（图3f）。研究结果表明，无论白血病样本类型如何，As@Fn总是能够特异性地识别并结合白血病细胞(图3g)。与ATO相比，这种特异性导致对来自不同类型白血病患者的白血病细胞的细胞毒性增强(图3h)。
As@Fn体内的靶向能力
为了比较ATO和As@Fn在静脉注射后白血病小鼠中的生物分布，研究人员建立了HL-60白血病小鼠模型（图4a）。结果显示，As@Fn组小鼠的心、肝、脾、肺、肾和大脑中的As分布明显低于ATO组（图4b），这突出了As@Fn对正常器官的毒性副作用明显减少。此外，研究人员还发现As@Fn（107.4分钟）的血液半衰期比ATO（10.1分钟）长10.6倍。
图4. As@Fn在体内靶向白血病细胞的能力评估
可以合理地假设，大幅增加As@Fn在循环系统中的保留时间，可使其与CD71的相互作用大幅增加，从而促进靶向白血病细胞作用。研究结果显示（详见图4），与ATO（17%；图4g）相比，白血病细胞中的As积累百分比大幅增加（69%）。
体内抑制白血病的发展
在开始体内白血病抑制分析之前，研究人员证实了与游离ATO（3-5mg kg-1）相比，As@Fn（2-8mg kg-1）的治疗窗口扩大，因此能够合理地将5mg kg-1的剂量设置为评估不同类型白血病的治疗结果。对于AML，研究人员构建了一个相应的小鼠模型，该模型具有稳定表达荧光素酶的HL-60细胞（Luc-HL-60；图5a），这些小鼠被随机分为四组之一：磷酸盐缓冲盐水（PBS）对照组、Fn组、ATO组或As@Fn组。研究结果表明，As@Fn的强大治疗效果导致了更长的生存时间；接受抗CD71抗体的小鼠对As@Fn治疗有耐药性，再次强调了Fn载体在这种针对白血病治疗中的重要作用。除了AML，As@Fn还对ALL和CML表现出强大的抗白血病作用，支持将ATO扩展到更多类型的白血病的治疗可行性（详见图5）。
图5. HL-60（AML）异种移植物体内抗白血病作用
为了进一步评估As制剂的潜在临床用途，研究人员建立了一个ALL-PDX模型（图6a）。研究结果显示，As@Fn对患者白血病细胞的细胞毒性显著增强，与ATO相比，IC50值下降了3.1倍（图6e）。
图6. 在ALL-PDX模型中具有抗白血病活性
最后，研究人员使用PDX模型小鼠进行了体内实验，并随机分为四个治疗组：PBS组，临床ALL治疗常用的联合疗法（长春新碱和地塞米松）组，ATO组和As@Fn组。与研究人员对上述CDX模型的观察类似，As@Fn治疗具有强大的抗白血病效果，优于其他治疗方法。WBC计数表明，PBS治疗组的WBC大幅增加，这表明恶性肿瘤水平很高。通过ATO的治疗，这种情况略有改善，在长春新碱和地塞米松治疗组中实现了更好的抗白血病效果。然而，As@Fn组的白细胞增幅在35天内受到显著抑制（图6f）。相应地，在As@Fn组中观察到大鼠体重稳定，脾肿大显著下降（图6g），而PB、BM和脾脏等各种组织中抑制的白血病发展也提供了更多证据（图6h）。研究人员跟踪了PDX模型小鼠的存活率，发现其他三组的小鼠都在大约5周内死亡，而75%的As@Fn治疗小鼠在6周后还活着（图6i）。
研究结论
研究人员搜集了167名白血病患者的临床材料，发现CD71总是由不同亚型和疾病进展阶段的白血病患者高度表达，证实了CD71是白血病的稳定治疗靶点。基于上述临床发现，研究人员随后利用配体蛋白合理设计了用于靶向治疗的AsIII仿生载体。As@Fn纳米药物与具有高CD71表达的HL-60AML白血病细胞结合，表现出高亲和力，比ATO具有更强的细胞毒性作用。除了AML，研究人员还将范围扩展到可能对As@Fn敏感的白血病类型（ALL和CML），这在多个细胞系检测、三种类型的异种移植实验和一个PDX模型中都得到了验证。这些结果共同凸显了As@Fn作为抗白血病药物的强大潜力，并支持As@Fn对各种类型白血病的进一步临床评估。
1、Wang C, Zhang W, He Y, Gao Z, Liu L, Yu S, Hu Y, Wang S, Zhao C, Li H, Shi J, Zhou W, Li F, Yue H, Li Y, Wei W, Ma G, Ma D. Ferritin-based targeted delivery of arsenic to diverse leukaemia types confers strong anti-leukaemia therapeutic effects. Nat Nanotechnol. 2021 Dec;16(12):1413-1423. doi: 10.1038/s41565-021-00980-7. Epub 2021 Oct 25. PMID: 34697490.
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