近年来，“焦亡”被认为是程序性细胞死亡（PCD）的一种炎症形式，并与细胞凋亡密切相关。虽然细胞凋亡在慢性淋巴细胞白血病（CLL）中的作用已得到广泛研究，但细胞焦亡基因与CLL之间的关系仍不清楚。因此，本文旨在CLL和正常B细胞之间识别出差异表达的焦亡相关基因（PRGs）并进一步验证其在指导CLL患者预后中的价值及其在抗肿瘤免疫中如何发挥作用。
研究背景
CLL是西方最常见的白血病，具有较强的异质性。随着对CLL的生物学和遗传特性认识的不断增加，目前已发现多种生物标志物可预测其预后。其中，国际CLL预后指数（CLL-IPI）是临床应用最广泛的预后模型，其包括TP53状态、免疫球蛋白重链可变区（IGHV）突变状态、血清β2-微球蛋白浓度、临床分期和年龄。该模型将CLL患者分为4个预后亚组，且能够识别无法从常规免疫化疗中获益的高危CLL患者。然而，新药、非细胞毒性药物是否能够克服这些不良因素仍有待探索。因此，筛选高危CLL患者中异常表达的基因及异常调控的通路具有重要意义。
新的靶向药物包括Bruton酪氨酸激酶（BTK）抑制剂、BCL-2抑制剂和PI3Kδ抑制剂极大地改变了CLL治疗的前景。其中，维奈托克（靶向BCL-2）是CLL有效且有前途的治疗选择。抑制抗凋亡的BCL-2蛋白会刺激线粒体外膜通透性（MOMP），并促使细胞色素C的释放和Caspase级联反应的激活。值得注意的是，半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3（Caspase-3）是细胞凋亡和焦亡途径中共同的关键分子，它与GSDME协同作用可实现细胞凋亡和焦亡之间的转换。虽然CLL的凋亡机制得到广泛认可且BCL-2抑制剂在临床实践中被广泛应用，但CLL潜在的焦亡失调机制研究尚不足。
焦亡是一种新型的PCD，具有细胞肿胀、溶解和释放许多炎症因子的特征，而凋亡为非炎症性PCD。气体蛋白家族是焦亡的主要候选者，并通过两种主要途径激活焦亡(1)：Caspase1/4/5/11调控的气体蛋白D（GSDMD）依赖的激活，以及(2)Caspase3调控的气体蛋白E（GSDME）依赖的激活。化疗药物如紫杉醇、顺铂、阿霉素等可诱导细胞凋亡以抑制肿瘤进展，某些药物可能引起Caspase3依赖的凋亡向焦亡的转变。因此，焦亡在CLL中的作用，特别是在维奈托克治疗或其他化疗中仍有待探索。此外，炎症细胞因子（IL-1b、IL-18和IL-16）和ATP、HMGB1的释放可能具有免疫原性，招募并激活免疫细胞。然而，炎症的作用是促进肿瘤还是抑制肿瘤，取决于特定肿瘤的生物学特征，目前仍待进一步研究。
研究方法
该研究下载的GEO数据集汇总在表1，从而获取CLL和正常B细胞之间差异表达的焦亡相关基因。通过单因素和多变量Cox回归分析，筛选出与预后相关的PRGs，并建立预后模型，进一步根据PRG模型评分将患者分为高风险和低风险组。比较两个亚组间的差异表达基因（DEGs）的功能富集分析及免疫细胞浸润情况。此外，该研究在GEO数据集和真实世界初治CLL队列之间中分析IGHV突变和未突变CLL患者中PRG表达的预后意义。该PRG模型的有效性同时在该研究中心也得到了验证。
表1. 研究中使用的GEO数据集汇总
图1. 研究流程图
研究结果
识别CLL细胞与正常B细胞之间差异表达的PRGs
对来自9个健康供体的15个CLL样本和正常B细胞的DEGs进行分析，并从33个PRGs中筛选出18个PRGs（调整后p < 0.05）。其中，12个基因（AIM2、CASP3、CASP6、GSDMA、GSDMD、GSDME、GSDME、NLRP2、NOD1、NOD2、PLCG1、PYCARD、SCAF11）表达上调，另外6个基因（CASP8、CASP9、GSDMB、IL-1B、IL6、NLRP3）表达下调（图2A、B）。为了验证差异表达的焦亡相关基因，该研究在另外1个包括188个CLL样本和32个CD19+正常B细胞的队列中同样进行了差异表达基因分析。研究发现在两个队列的CLL样本中，有6个基因（AIM2、GSDME、NOD2、PLCG1、PYCARD和GSDMD）表达上调，2个基因（IL6和NLRP3）表达下调（图2C）。为了进一步探索CLL中焦亡信号的潜在机制，该研究应用 Metascape进行了功能分析。GO分析结果显示，这些异常调控的PRGs主要在应激、代谢及免疫系统等信号通路中富集（图2D）。因此，这些结果提示有必要探索肿瘤微环境（TME）的变化与PRGs的失调之间的关系。通过构建蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络进一步揭示失调的PRGs之间的作用（图2E）。PPI网络提示PYCARD、AIM2、NLRP3和GSDMD为枢纽基因，均为CLL与正常B细胞之间的DEGs。
图2. CLL中差异表达的焦亡相关基因特征
构建PRGs预后模型
该研究从GEO中获得标准化的mRNA表达数据，采用单因素Cox回归分析，在151例CLL患者样本中筛选出与OS显著相关的差异表达PRGs，其中4个PRGs（GSDMD、GSDME、NLRP3和PLCG1）与预后相关（图3A）。进一步的多因素Cox回归分析提示GSDME、NLRP3和PLCG1为独立的预后不良因素（图3B，表2）。因此，该研究基于上述3个PRG建立了PRGs预后模型，并计算了每个患者的风险评分。计算公式如下：
风险评分=（0.1950×GSDME exp.）+ (−1.0171 × NLRP3 exp.)+ (−1.2174 × PLCG1 exp.)
根据151个CLL样本的中位风险评分，对高风险组（n = 75）和低风险组（n = 76）进行分层。结果显示高风险组患者中位OS明显短于低风险组OS（HR=3.0657，p<0.001，图3C）。采用时间依赖性ROC评估预后模型的有效性，结果显示3年生存率的曲线下面积（AUC）为0.722，5年生存率为0.748，10年生存率为0.717（图3D），表明该预测模型是有效和可靠的。图3E-G显示了PRGs评分在高低风险亚组中的风险评分、生存状态和表达谱的热图。为了验证建立的预后模型的有效性，101 例有TTFT数据的CLL样本分为高风险组（n = 50）和低风险组（n = 51），其仍具有预后分层意义（图3H-K）。
图3. 根据多变量Cox回归分析构建预后模型
验证PRGs预后模型
该研究接着使用GES39671中的另1个独立的130例初治 CLL队列来评估PRGs预后模型的可靠性和准确性。Kaplan-Meier分析显示，PRGs预后模型可有效将患者分为和高风险（n = 65）和低风险（n = 65）亚组，高风险组的中位TTFT明显低于低风险组（HR = 3.1030，p < 0.001，图4A）。ROC曲线显示的1年的AUC为0.682,3年的AUC为0.725，5年AUC为0.709（图4B），PRGs预后模型在验证队列中也显示了可靠的预测价值（图4C，D）。GSDME基因高表达的CLL患者OS（HR = 3.4918，p < 0.001）和TTFT（HR = 3.201，p < 0.001）均较差，而NLRP3和PLCG1高表达显示CLL预后良好（图5A-C）。
图4. 验证PRGs预后模型
图5. 焦亡相关基因的Kaplan-Meier生存比较
高、低风险亚组间DEGs的功能分析
为了进一步探索PRGs失调机制，该研究通过识别高风险和低风险组之间的DEGs，共鉴定出191个上调基因和215个下调基因并进行了GO和KEGG通路富集分析。GO富集分析显示，DEGs主要在应对刺激、免疫调节、代谢等信号通路中富集（图6A）。KEGG分析表明，NF-kappa B通路相关基因、凋亡、MAPK、炎症通路如TNF、细胞因子-细胞因子受体相互作用，趋化因子，和免疫通路如PD-1和PD-L1检查点，Th1和Th2细胞分化下调（图6B），而先天免疫缺陷相关基因、B细胞受体（BCR）和多物质代谢通路上调（图6）。此外，GSEA还证实了PRGs预后模型中的高风险组中脂肪酸代谢和氧化磷酸化等代谢途径上调，而凋亡和炎症通路下调（图6D，E）。
图6. 高、低风险亚组间DEGs的功能分析
高、低风险亚组间免疫状态比较
该研究通过ssGSEA评估了151例CLL样本队列和130例CLL样本队列中高低风险组中14种免疫细胞的富集评分和13种免疫相关通路的活性。结果显示，高风险组的免疫细胞浸润水平普遍低于低风险亚组，特别是CD8+ T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞（NK）细胞、T辅助细胞、1T辅助细胞（Th1）和2T辅助细胞（Th2）（图7A、B）。此外，高风险组免疫活性普遍下调，包括抗原-呈递细胞（APC）共抑制、APC共刺激、趋化因子和细胞因子受体（CCR）、检查点、炎症促进、T细胞共刺激、I型干扰素（IFN）和II型IFN反应下调（图7C，D）。
图7. 高、低风险亚组间免疫细胞和免疫通路的ssGSEA评分的比较
验证PRGs模型的临床预后价值
IGHV是CLL中的预后生物标志物之一，并在疾病的发展过程中保持不变。未突变的IGHV是影响CLL患者OS和TTFT的关键危险因素。因此，该研究进一步验证了PRGs的表达在IGHV未突变和IGHV突变状态CLL患者中的预后意义。结果显示，相较于IGHV突变的CLL，IGHV未突变的CLL患者GSDME和PLCG1的表达显著更高（图8A）。此外，采用该研究中心39例初治CLL患者验证PRGs风险模型得到一致结论。高风险组TTFT明显短于低危组（p = 0.006，图8B），同时OS有短于低危患者的趋势（p = 0.078，图8B）。高危组比低危组IGHV未突变CLL患者更多（图8C）。PRGs风险评分也与CLL-IPI评分具有较高的一致性（R2 = 0.5196，p < 0.001，图8D），表明该研究建立的PRGs风险模型与临床实践中的预后因素一致性好。
图8. 焦亡相关基因表达与临床预后生物标志物的相关性
研究结论
综上所述，该研究筛选出了CLL和正常B细胞之间差异表达的PRGs。基于3个PRGs建立的预后模型能够将CLL患者区分为高风险和低风险组且有效预测患者的OS和TTFT。功能和免疫状态分析揭示了高风险组CLL患者的焦亡通路失调可能是导致抗肿瘤免疫能力下降的原因。
Sha Y, Jiang R, Miao Y, et al. The pyroptosis-related gene signature predicts prognosis and indicates the immune microenvironment status of chronic lymphocytic leukemia. Front Immunol. 2022 Sep 13;13:939978. doi: 10.3389/fimmu.2022.939978.
CN-105317
排版编辑：肿瘤资讯-Pinky
苏公网安备 32059002004080号
