您好,欢迎您

Cancers|神经酰胺激酶 (CerK) 或成三阳性和三阴性乳腺癌治疗的共同靶点!

2022年09月29日
编译:肿瘤资讯
来源:肿瘤资讯

乳腺癌患者现有化疗方案的毒性较高。三阳性乳腺癌可用的选择比较有限,三阴性乳腺癌的靶向治疗也仍在探索中。因此,需要确定两种乳腺癌的共同治疗靶点。2022年9月16日《Cancers》杂志在线刊登了题为“Ceramide Kinase (CerK) Emerges as a Common Therapeutic Target for Triple Positive and Triple Negative Breast Cancer Cells ”的研究,探讨了纳米颗粒/水凝胶为载体的CerK靶标用于乳腺癌治疗的前景。

1.png

一、研究背景

神经鞘脂类(sphingolipids, SL)又称鞘脂类,是以神经鞘氨醇(sphingosine, Sph)为基本结构的复合脂类总称。SL广泛存在于真核细胞质膜中,具有很高的生物活性,在细胞生物学和胞内信号转导中发挥重要作用。SL分为游离Sph类、神经酰胺(ceramide, Cer)类、神经鞘磷脂(sphingomyelin, SM)类以及神经鞘糖脂(glycosphingolipid, GSL)类四种类型。

Cer是鞘脂代谢的中心分子,是所有主要鞘脂的前体。作为细胞内第二信使分子,Cer通过多种信号途径介导各种细胞过程,如增殖、凋亡、分化和生长停滞。在肿瘤的发生、发展中,Cer可以抑制肿瘤的发生、转移以及增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。Cer的抗肿瘤活性,可为恶性肿瘤的治疗提供新的靶点和思路。

神经酰胺激酶(ceramide kinase, CerK)是唯一已知的在哺乳动物细胞中催化Cer磷酸化为1-磷酸神经酰胺(ceramide-1-phosphate, C1P)的脂蛋白酶。CerK参与调控细胞增殖、凋亡与迁移。C1P的生理作用与Cer相反,C1P是一个强有力的凋亡抑制剂, C1P亦可以通过激活PI3K/PKB,JNK和ERK1/2通路来刺激细胞增殖。因此,阻断CerK来减少C1P的生成是神经酰胺类制剂中激酶抑制剂抗肿瘤作用的靶点。
 
鞘氨醇激酶-1(SphK1)磷酸化 Sph生成1-磷酸鞘氨醇(S1P),与Cer不同的是,S1P刺激细胞增殖、生存、转移、血管生成和调节免疫功能。
 
现有研究表明,Cer、CerK、C1P及S1P均参与调控肿瘤细胞增殖、存活、凋亡与迁移/转移,与肿瘤发生和发展密切相关,是抗肿瘤治疗的潜在靶点。

脂质代谢重编程已成为癌症发病机制的关键特征。研究表明,SL在乳腺癌疾病进展过程中显示出代谢改变。关键SL的不同调节机制影响着炎症、血管生成、细胞增殖、凋亡和耐药性。因此,分析SL种类并将其与不同乳腺癌亚型中SL代谢相关酶的表达相关联,将有助于鉴定不同乳腺癌亚型治疗的共同靶标。

三阴性乳腺癌 (TNBC,ER-/PR-/HER2-) 三阳性乳腺癌 (TPBC,ER+/ PR+/HER2+) 亚型揭示了不同的表型特征影响其对治疗的反应和预后。早期的研究报道了luminal (ER+/PR+) 和 TNBC (ER-/PR-/HER2-) 亚型的SL特征。然而,尚无研究比较 TPBC 和 TNBC 亚型的鞘脂谱及其与这些细胞表型的相关性。鉴于此,本研究介绍了TPBC和 TNBC 亚型癌细胞的独特鞘脂谱特征,以及其表型(增殖和迁移)特征与相应代谢基因/酶表达的相关性。

二、研究方法

研究选择了分别代表TPBC和TNBC亚型的BT-474和MDA-MB-231乳腺癌细胞系。这两种人乳腺癌细胞系均由美国模式培养物保藏所(ATCC,Manassas,VA)获得。

体外实验

细胞培养:在含10%胎牛血清、100单位/mL 青霉素和100 µg/mL链霉素的 DMEM 高糖培养基中培养人乳腺癌细胞系 BT-474 和MDA-MB-231。

siRNA细胞转染:BT-474 和 MDA-MB-231 细胞用 Lipofectamine 2000 转染siRNA(靶向CerK或CerK对照)。

增殖试验:使用 BT-474 和 MDA-MB-231 细胞或 siRNA 转染细胞按照先前描述的方法进行细胞增殖试验。

随后进行 transwell 迁移试验RNA 和蛋白质分离试验。采用先前描述的方法进行 RNA 提取和定量反转录PCR(qRT-PCR)研究。通过免疫印迹法(Western Blot)进行进行蛋白表达分析,采用 ImageJ 软件对蛋白免疫印迹图像进行定量测定。

使用 LC-MS/MS 分离和定量SL的水平。即进行细胞集落采集、脂质分离、LC-MS/MS分析SL的定量。

动物试验

 所有肿瘤生长动力学实验均在雌性 NOD SCID CB.17小鼠中进行。

  • 肿瘤动力学实验

将相应细胞(BT-474和MDA-MB-231)注射于小鼠侧腹部。一旦出现可触及肿瘤 (20 ~ 30 mm3)后,每两天记录小鼠的肿瘤体积和重量。研究根据公式L×B2/2计算肿瘤体积,其中 L 为肿瘤长度,B为肿瘤宽度。实验结束后,切除肿瘤,并储存在-80℃的 Allprotect 组织试剂中用于进一步分析。

  • siRNA 实验

将具有可触及肿瘤 (20 ~30 mm3) 的小鼠随机分为不同的组,每组有4 ~ 6只小鼠。第1组小鼠不作处理,第2组小鼠瘤内注射对照siRNA(scrambled siRNA),第3组小鼠给予靶标siRNA(CERK siRNA)处理。共给药6次,每隔2天进行一次肿瘤测量。

  • 抑制剂实验

将可触及肿瘤 (20 ~ 30 mm3) 的小鼠随机分为不同组,每组有4 ~ 6只小鼠。第1组小鼠不作处理,第2组小鼠皮下注射CerK抑制剂 (NVP-231) 。每两天测量两组小鼠的肿瘤体积和质量。

随后进行脂质组学实验以定量代谢物的水平。并对比 MDA-MB-231 和 BT-474 两组的结果。

三、研究结果


3.1 TPBC和TNBC细胞具有独特的SL特征

研究使用 LC-MS/MS 对27种SL进行了定性和定量鞘脂组学研究。图1显示 MDA-MB-231 细胞系中Cer、乳糖神经酰胺、C1P和 S1P 的水平高于 BT-474 细胞。而BT-474细胞系中的葡萄糖神经酰胺和SM水平较高。

1.png

图1 热图显示 BT-474 和 MDA-MB-231 细胞系中的不同SL水平

3.2 TPBC和TNBC细胞中SL代谢相关基因的表达不同

具有不同组织病理学特征的乳腺癌亚型表现出不同程度的异质性和不同的基因表达模式。因此,研究评估了SL代谢的基因转录丰度。Cer的合成主要包括3条途径,分别为从头合成途径、补救合成途径和鞘磷脂酶途径。

从头合成途径的结果表明,与TPBC(BT-474 )相比,TNBC细胞系(MDA-MB-231)中Cer的合成显著上调(图2A)。

补救合成途径的结果显示,MDA-MB-231 细胞系中 CerK 转录表达上调(> 45.0倍,P< 0.01)(图2B),这与较高的 C1P 水平密切相关。

鞘磷脂酶水解途径中,研究观察到与 BT-474 细胞系相比,MDA-MB-231细胞系中鞘磷脂磷酸二酯酶1 (SMPD1)、SMPD2、SMPD3、SMPD4的高表达(图2C)。

研究观察到与 BT-474 细胞系相比,MDA-MB-231细胞系中葡糖神经酰胺合成酶 (UGCG) 增加>100.0倍 (P < 0.0001),B4GALT6表达增加>50倍 (< 0.01)(图2D)。

1.jpg

图2 与BT-474细胞系相比,MDA-MB-231细胞系中不同SL代谢的基因表达数据

3.3 TPBC和TNBC细胞中SL代谢相关酶的表达不同

研究者从基因表达结果中选择了一些SL代谢酶,并通过免疫印迹法比较了这些酶在 BT-474 和 MDA-MB-231 细胞系中的蛋白表达情况。结果显示,与 BT-474 细胞系相比,DAMB-231细胞系显示神经酰胺合成酶(ceramide synthase, CerS)1、CerS4、CerS5的高表达,但CerS6的表达偏低。详见图3。 

1.jpg

图3 BT-474 和 MDA-MB-231 细胞系中不同蛋白的表达情况

3.4 TPBC 和 TNBC 细胞表现出不同的细胞增殖和迁移能力

细胞增殖动力学结果显示BT-474细胞系的增殖能力更强(图4 A)。细胞集落的记录结果显示MDA-MB-231细胞系形成的集落数量较多(图4 B)。迁移细胞数量的量化结果显示MDA-MB-231的迁移细胞数量更多(图4 C)。肿瘤生长动力学(D),最终肿瘤体积(E)和切除肿瘤的照片(F)证实了BT-474肿瘤的增殖能力更强(图4 D-F)。

1.jpg

图4  BT-474 和 MDA-MB-231 细胞系细胞增殖和迁移能力的结果

我们从增殖、集落形成和迁移测定中获得的数据证实,两组细胞系相比,BT-474细胞系表现出更高的细胞增殖速率,MDA-MB-231细胞系表现出更高的迁移速率,这使得两种亚型特异性细胞系在表型行为上具有独特性。

与BT-474细胞相比,MDA-MB-231细胞系由于CerS表达增强而导致的Cer水平升高可能是其增殖速率较低的原因。同样,与MDA-MB-231细胞系相比,SM水平的升高可能是BT-474细胞系增殖速率较高的原因。有趣的是,MDA-MB-231细胞显示出CerK、SPHK1和SPHK2的表达增强,并且具有高水平的C1P和S1P,这可能是其迁移能力更强的原因,因为CerK在细胞增殖和迁移中起着双重作用。

3.5 CerK抑制可减少TPBC和TNBC细胞中的细胞增殖、集落形成和迁移

为了验证CerK是TPBC 和 TNBC细胞的共同治疗靶点,研究采用 siRNA 介导的敲低CerK以及小分子介导的抑制CerK,并在 BT-474 和 MDA-MB-231 细胞系中检测其对细胞增殖、集落形成和细胞迁移的影响。

  • 通过 siRNA 敲低CerK的研究结果

我们观察到 siRNA 介导的敲低CerK在 72 h 后降低了 BT-474 细胞系的细胞增殖(图5A)。siRNA敲低CERK 可诱导 BT-474 细胞集落数减少(图5B)。但是,siRNA介导的CerK敲低未反映出BT-474 细胞迁移数量的显著变化(图5C)。有趣的是,在 MDA-MB-231 细胞系中通过 siRNA 敲低CerK后,细胞增殖(图5D)、集落数量(图5E)和细胞迁移均显著降低(图5F)。

  • CerK抑制剂(NVP-231)的研究结果

在BT-474 细胞系中,与未处理细胞的结果相比,用NVP-231处理后细胞增殖降低(图5G),细胞集落数量减少(图5H)。Transwell 迁移试验显示,NVP-231处理后迁移细胞数量减少(图5I)。同样,NVP-231处理后 MDA-MB-231 细胞系的细胞增殖降低(图5J),细胞集落数量减少(图5K),迁移细胞数量减少(图5L)。

因此,这些结果证实通过 siRNA 在翻译水平抑制CerK是 TPBC 和 TNBC 细胞共同的治疗靶点。

1.jpg

图5 siRNA 介导的敲低CerK和CerK抑制剂对 BT-474 和 MDA-MB-231 细胞增殖、集落形成和细胞迁移的影响

3.6 不同给药策略对肿瘤进展的影响

局部siRNA递送,即直接将siRNA治疗应用于靶组织,具有许多好处,包括在接近靶组织的情况下,药物具有更高的生物利用度,以及与全身性给药相关的不良反应会大大减少。

研究采用两种策略来评价 CerK 的给药操作对肿瘤进展的影响。第一种策略使用纳米颗粒为载体的CerK-siRNA递送到肿瘤组织。第二种策略使用水凝胶为载体的 CerK 抑制剂在肿瘤部位附近局部递送,并确定它们对肿瘤生长的影响。

3.6.1 纳米颗粒为载体的CerK-siRNA局部递送可抑制肿瘤进展

研究使用了聚合物 (TAC6)和siRNA靶向CerK的工程复合物(称为siRNA NPs)。研究将 BT-474 和 MDA-MB-231 荷瘤小鼠随机分为3组,第1组小鼠不作处理第2组小鼠用含对照siRNA(scrambled siRNA) 的对照siRNA工程复合物(siRNA SCRAM NPs) 处理第3组小鼠用CerK-siRNA的siRNA CerK NPs处理

肿瘤生长动力学结果显示,siRNA介导的敲低CerK 抑制了 BT-474 肿瘤生长(图6),同样,我们也观察到工程复合物(NP)为载体的 siRNA 递送抑制了 MDA-MB-231 肿瘤的生长。因此,这些结果证明 NP 为载体的CERK-siRNA 局部递送可能是降低 TPBC 和 TNBC 模型中肿瘤生长动力学的有效策略。

1.jpg图6  (A–C) 为BT-474 细胞系肿瘤生长动力学结果: (A)最后一天的肿瘤体积,(B) 和切除肿瘤的图片,(C)3组小鼠不同处理的结果; (D–F) 为MDA-MB-231细胞系肿瘤生长动力学结果: (D)最后一天肿瘤体积, (E) 切除肿瘤的图片,(F) 3组小鼠不同处理的结果

3.6.2 水凝胶为载体的 CerK 抑制剂递送可缓解肿瘤进展

BT-474 和 MDA-MB-231 荷瘤小鼠被随机分为两组,其中第1组小鼠不作处理,第2组小鼠在肿瘤部位附近皮下植入水凝胶(NVP-231-Gel)。

肿瘤生长动力学研究明确表明,与未处理的肿瘤相比,用 NVP-231-Gel 处理 BT-474和MDA-MB-231肿瘤均减缓了肿瘤生长动力学(图8A)。因此,结果表明水凝胶为载体的 CerK抑制剂的局部递送也可能是降低 TPBC 和 TNBC肿瘤生长动力学的有效策略。

四、讨论

TPBC 和 TNBC 细胞的基因和鞘脂代谢特征表明 CerK 是对抗两种亚型肿瘤细胞增殖和迁移的合适靶点。

研究发现在 CerK 抑制的实验中,luminal型 BT-474 细胞增殖显著降低,肿瘤显著消退。这证明 CerK 可能是 luminal 亚型原发性肿瘤的良好治疗靶点同时,MDAMB-231细胞系中细胞迁移的显著减少,异种移植肿瘤模型中肿瘤生长速度的减缓均表明 CerK 下调对于原发性肿瘤的消除和 TNBC 细胞中播散肿瘤细胞的迁移同样重要。

既往相关研究显示与 ER+乳腺癌相比,ER-乳腺癌中 CerK 表达水平更高。ER-癌症预后更差、生存期更短和复发率更高与 CerK 表达水平更高呈正相关。

聚合物和纳米颗粒已成为基因治疗的有效载体。近年来,临床前研究表明,水凝胶为载体的局部化疗药物给药是缓解疾病病理生理学的一种有前景的策略,且无任何毒性,因为其不允许药物分布至非预期器官。本研究显示用CERK-siRNA 定位递送聚合物可降低肿瘤生长动力学,且水凝胶植入物也可以包裹 CERK 抑制剂,使聚合物和基于水凝胶的植入物有成为未来基因治疗的潜在选择。

五、研究结论

综上所述,TPBC 和 TNBC细胞系的不同SL特征提供了潜在的治疗靶标,如CerK、纳米颗粒/水凝胶介导的此类靶标的药理学操作为未来恶性肿瘤的治疗提供新的靶点和思路。


参考文献

[1]   RAJPUT K, ANSARI M N, JHA S K, et al. Ceramide Kinase (CERK) Emerges as a Common Therapeutic Target for Triple Positive and Triple Negative Breast Cancer Cells[J/OL]. Cancers, 2022, 14(18): 4496. https://doi.org/10.3390/cancers14184496.

[2]刘哲,李博,李龙江.神经酰胺抗肿瘤作用的研究进展[J].现代口腔医学杂志,2016,30(01):39-42.

[3]陈路芳,卢小东,邵启祥,覃文新.神经酰胺的功能及其在肿瘤发生发展中的作用[J].生命科学,2014,26(07):725-731.DOI:10.13376/j.cbls/2014101.

责任编辑:肿瘤资讯-Paine
排版编辑:肿瘤资讯-Paine

               

版权声明
本文专供医学专业人士参考,未经著作人许可,不可出版发行。同时,欢迎个人转发分享,其他任何媒体、网站如需转载或引用本网版权所有内容,须获得授权,且在醒目位置处注明“转自:良医汇-肿瘤医生APP”。
   

领取更多福利>>
查看详情

评论
2022年10月07日
郭永轶
西吉县人民医院 | 外科
TPBC 和 TNBC 细胞的基因和鞘脂代谢特征表明 CerK 是对抗两种亚型肿瘤细胞增殖和迁移的合适靶点。
2022年10月07日
张歌
广东祈福医院 | 肿瘤内科
CerK参与调控细胞增殖、凋亡与迁移。
2022年10月06日
白文秀
平遥兴康医院 | 中医科
感谢分享受益匪浅