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左旋门冬酰胺酶通过PI3K/Akt/mTOR通路与依托泊苷协同作用于Epstein-Barr病毒阳性伯基特淋巴瘤

2022年07月18日

整理：肿瘤资讯

桑威

医学博士，副教授，副主任医师，硕士生导师

徐医附院细胞研究和转化医学中心副主任

徐医附院血液科科副主任,淋巴瘤病区主任

中华医学会血液学分会淋巴细胞疾病学组委员

中国抗癌协会淋巴瘤专委会委员

中国EBV相关疾病工作组秘书长

中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会青年委员

中国抗癌协会血液肿瘤委员会慢淋工作组委员

中国抗癌协会第一届T细胞淋巴瘤工作组委员

中国老年医学会血液学分会淋巴瘤学组委员

江苏省淋巴瘤联盟副主席

江苏省医学会血液学分会淋巴瘤/骨髓瘤学组委员

江苏省“六大人才高峰”培养对象

江苏省“科教强卫工程”青年医学人才

涂冬云

徐州医科大学附属医院血液内科2019级硕士研究生

研究背景

伯基特淋巴瘤(BL)是一种侵袭性Epstein-Barr病毒(EBV)驱动的B细胞淋巴瘤，其特征在于c-Myc原癌基因的易位和重排。高强度多药化疗方案对难治性或复发性BL患者的生存影响有限，主要是由于高 EBV 负荷和耐药性。L-天冬酰胺酶(L-Asp)和依托泊苷(VP-16)在EBV相关淋巴组织增生性疾病中发挥有益作用；然而，它们在BL中的作用和机制仍不清楚。

研究方法

用VP-16和L-Asp处理BL细胞，然后测量细胞活力、细胞周期、细胞凋亡、自噬和特定的细胞信号通路。此外，小鼠被植入 BL 细胞，然后用VP-16和L-Asp的组合进行治疗，以分析肿瘤负荷和存活率。

研究结果

L-Asp经常作为治疗淋巴细胞白血病和ENKTL的关键部分。为了探索L-Asp是否增强VP-16在BL细胞中的促凋亡作用，CCK-8测定被用于分析药物剂量矩阵并获得每种组合的生长抑制百分比（图 1A）。使用CompuSyn确认了L-Asp 和VP-16之间的协同作用，并为每个测试的细胞系获得了CI（图1B）。如图1A和1B所示，VP-16和L-Asp在EBV阳性的Raji和Namalwa细胞中具有协同作用，但在EBV阴性的CA46细胞中没有。同时，我们使用Annexin V染色流式细胞术检测了单独使用 VP-16 或与 L-Asp 组合对 Raji、Namalwa 和 CA46 细胞的凋亡诱导。如图 1C 和 1D 所示，当用 VP-16 和 L-Asp 的组合处理 Raji 和 Namalwa 细胞时，检测到细胞凋亡增加。然而，L-Asp 并没有进一步提高 CA46 细胞凋亡的百分比（图 1E-F）。因此，我们的结果表明 L-Asp 特异性增强了 VP-16 在 EBV 阳性细胞中的凋亡作用。此外，我们检测了EBV相关基因LMP1的表达，发现Raji为LMP1阳性，Namalwa几乎不表达LMP1，而CA46为LMP1阴性（图1G）。通过蛋白质印迹，我们显示 VP-16 抑制了Raji细胞中 LMP1 的表达（图 1H），VP-16 与 L-Asp 结合更能降低 LMP1 水平（图 1I）。

图 1. L-Asp 增强 VP-16 在 EBV 阳性 BL 细胞中的促凋亡作用

为了研究 L-Asp 和 VP-16 在体内的抗肿瘤作用，我们在 NPG 小鼠中进行了实验。NPG 小鼠静脉注射 2.0×106 Raji-GFP-Luc 细胞，从第 10 天起通过 IVIS 成像诱导可见的肿瘤形成（图 2A）。结果表明，VP-16抑制BL细胞的生长，而L-Asp作为单药显示出轻微的抗肿瘤活性（图2A和2B）。令人惊讶的是，与未治疗的对照组和每个单独的组相比，L-Asp 和 VP-16 组合显著抑制了肿瘤负荷。生存分析表明，VP-16 加 L-Asp 处理的小鼠的生存时间明显长于对照组和每个单组（图 2C）。这些结果表明，药物联合治疗的疗效比体内单一VP-16或单一L-Asp治疗的疗效更显著。

图 2. L-Asp 和 VP-16 的组合显着延长了 BL 小鼠的存活时间

我们还通过在 NPG 小鼠中皮下接种 Raji 细胞（每只小鼠 2×106）建立了 BL 模型。双药组移植肿瘤的体积和生长速度明显低于 VP-16 和 L-Asp 单药组（图 3A-E），表明 L-Asp 可以辅助 VP-16抑制BL小鼠皮下移植肿瘤的生长。免疫组织化学染色用于评估从这些小鼠中分离的肿瘤的增殖效率。当小鼠单独用 L-Asp 和 VP-16 治疗时，Ki 67 的表达显着降低，并且在双药组中进一步有效降低（图 1F）。然后我们提取肿瘤组织并进行蛋白质印迹实验。我们发现与单一药物和对照相比，联合治疗显着增加了细胞凋亡。双药组进一步提高了 DR5 的表达和 Caspase8、Caspase3 和 PARP 的切割（图 3G）。双药组中促凋亡蛋白 Bax 和抗凋亡蛋白 Mcl-1 的变化更明显（图 3H）。此前，我们证明了 VP-16 加 L-Asp 在体外对 BL 细胞系中的 PI3K/Akt/mTOR 信号通路具有协同作用。在这里，我们发现与单药组相比，PI3K、Akt 和 mTOR 的磷酸化在体内双药组中降低了很多（图 3I）。总之，在小鼠模型中，L-Asp 与 VP-16 联合通过 PI3K/Akt/mTOR 信号通路抑制肿瘤生长。