华中科技大学同济医学院附属同济医院 血液内科
曾赴美国辛辛那提儿童医学中心作访问学者
主要方向为血液系统恶性肿瘤的诊疗及靶点探索
作为主要人员参与国家自然科学基金三项 至今已发表SCI论文十余篇，其中第一作者或共同第一作者5篇，包括Journal of Allergy and Clinical Immunology, Cellular & Molecular Immunology,Journal of Controlled Released,British Journal of Haemotology等
获ASH ABSTRACT ACHIEVEMENT AWARDS
淋巴瘤是起源于淋巴造血系统的血液系统恶性肿瘤。该疾病最常见的早期症状是无痛性淋巴结肿大。一般依据细胞形态学分为两大类：霍奇金氏淋巴瘤和非霍奇金氏淋巴瘤。治疗方法可能会合并化疗，放疗，手术，骨髓移植，免疫治疗等多种方式。淋巴瘤的免疫疗法近年来发展迅速且具备良好的应用前景，目前主要涉及细胞治疗和抗体治疗两个方面。细胞治疗主要以嵌合抗原受体修饰T细胞（Chimeric antigen receptor modified T cells, CAR-T cells）疗法为代表。该疗法通过基因工程技术使T淋巴细胞表达特异性抗体的结合位点，使其不依赖主要组织相容性复合体呈递识别肿瘤细胞表面的某种特定的肿瘤相关抗原，产生强有力的T细胞活化和强大的抗肿瘤反应，从而结合并杀伤相应的肿瘤细胞，已在血液系统肿瘤中被证明拥有越来越明确的疗效。
一、淋巴瘤CAR-T目前在研靶点
CAR-T疗法在淋巴瘤中的临床研究及应用首先主要集中在B细胞恶性肿瘤，包括弥漫大B细胞淋巴瘤、滤泡状淋巴瘤及套细胞淋巴瘤。另外在霍奇金淋巴瘤以及T细胞淋巴瘤也进行了多种靶点的尝试。
1.CD19
CD19是目前CAR-T疗法中最成功也是最热门的靶点，广泛表达在多种B细胞恶性肿瘤细胞表面，在正常B细胞、滤泡性树突状细胞表面也有表达，在其他组织和血液细胞表面没有表达，因此被认为是CAR-T治疗B细胞肿瘤的理想靶点。
目前，美国Kite Pharma公司的Axicabtagene Ciloleucel和Brexucabtagene Autoleucel，诺华公司的Tisagenlecleucel，Juno Therapeutics公司的lisocabtagene maraleucel四种靶向CD19的CAR-T细胞产品已经获得美国FDA批准，已被证实在复发难治侵袭性B细胞淋巴瘤患者中具有显著的临床活性。两款靶向CD19的CAR-T细胞产品阿基伦赛注射液、瑞基奥伦赛注射液2021年先后在中国获批上市，主要用于成人复发难治性大B细胞淋巴瘤（包括弥漫性大B细胞淋巴瘤非特指型，原发性纵膈B细胞淋巴瘤，高级别B细胞淋巴瘤和滤泡淋巴瘤转化的弥漫性大B细胞淋巴瘤）的治疗。这六种产品上市前临床数据均十分亮眼，以瑞基奥伦赛注射液为例，针对复发难治的淋巴瘤患者，其客观缓解率（ORR）为76%，完全缓解率（CR）为52%，中位缓解持续时间达8个月，一年总生存率超70%。3级以上细胞因子风暴和神经毒性发生率仅为5.1%和3.4% [1]。
2.CD20
CD20是除CD19之外的B细胞恶性肿瘤的另一个热门靶点，是一种B淋巴细胞限制性分化抗原，为疏水性跨膜蛋白，与调节B细胞活化增值有关。其主要表达在前B细胞，成熟B细胞和B细胞非霍奇金淋巴瘤细胞上。该靶点是治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤的有效靶点，已有多款基于此靶点成功开发的抗体药物上市。2021年欧洲血液学会在线会议上公布了一项靶向CD20的CAR-T疗法MB-106治疗高危B细胞非霍奇金淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病的1/2期临床试验的中期数据。共12例患者，ORR为92%，58%患者达到CR。接受最高2个剂量水平治疗的患者完全缓解率高达100%。细胞因子释放综合征3例，1级2例，2级1例。在中位4个月的随访中，完全缓解的7名患者仍然持续缓解，在试验中尚未观察到任何级别的免疫效应细胞相关的神经毒性综合征。
3.CD22
CD22是唾液酸结合免疫球蛋白样凝集素家族成员之一，也是B细胞表面抑制性辅助受体之一，其限制性地表达于成熟B细胞和大多数恶性B淋巴瘤细胞表面，因此是自身免疫疾病和B细胞恶性肿瘤治疗的热门靶点之一。Shalabi等在2018年发表的I期临床研究针对22例DLBCL和ALL患者，使用CD22 CAR-T疗法后，12例患者获得CR。未发现不可逆的神经毒性[2]。
4.CD30
霍奇金淋巴瘤缺乏CD19并包含一个高度免疫抑制的肿瘤微环境。CD30是肿瘤坏死因子（TNF）受体超家族成员之一，可通过激活不同的信号通路促进细胞增殖或凋亡。CD30在霍奇金淋巴瘤细胞和间变大细胞淋巴瘤表面高表达，在正常激活的T细胞和B细胞表面低表达，在健康细胞中不表达。这些特征符合理想靶抗原的特点。最近发表的一项多中心II期临床研究针对复发难治的CD30+淋巴瘤患者评估CD30 CAR-T联合PD-1抑制剂。12例患者被分为3组，分别接受10^6/kg和10^7/kg的CAR-T及10^7/kg的CAR-T联合PD-1抑制剂的治疗。患者的ORR为91.7%，其中6名患者CR。在11名ORR的患者中，7名患者在随访结束前保持应答，3名患者死于疾病进展。该研究还提示，CD30 CAR-T是治疗复发难治的CD30+淋巴瘤的重要治疗选择，但其疗效仍有提高空间。使用PD-1抑制剂联合CD30 CAR-T可以在毒性最小化的情况下取得ORR100%和CR80%的结果。同时CD30 CAR-T表现出良好的耐受性，细胞因子释放综合征（CRS）和神经系统毒性病例非常罕见[3]。
5.CD123
CD123广泛表达于骨髓增生异常综合征患者的骨髓细胞表面，同时也表达于多种血液系统恶性肿瘤，包括急性髓系白血病，B细胞急性淋巴细胞白血病，毛细胞白血病，母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤（BPDCN），霍奇金淋巴瘤等。美国FDA已授予MB-102（CD123 CAR-T）治疗BPDCN的孤儿药资格。但也有研究提示CD123 CAR-T对于霍奇金淋巴瘤有治疗作用。霍奇金淋巴瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAM）表面均表达CD123，并且体外研究提示霍奇金淋巴瘤细胞可以将巨噬细胞转化为抑制T细胞增殖的TAM。在免疫缺陷小鼠模型中，使用CD123 CAR-T可以消除霍奇金淋巴瘤细胞，识别并杀死TAM，克服免疫抑制作用并建立长期免疫记忆[4]。
6.CD4
CD4是一种在大部分T细胞淋巴瘤亚型中均匀表达的膜表面糖蛋白。大多数外周T细胞淋巴瘤呈CD4阳性，很少有CD8阳性，CD4和CD8双阳性或有NK细胞免疫表型。2016年，FDA已为iCell基因治疗公司的CD4 CAR-T细胞授予孤儿药称号，用于治疗外周T细胞淋巴瘤。2020年，FDA批准一款名为LB901的CD4 CAR-T产品的新药临床试验申请，用于治疗成人复发或难治性T细胞淋巴瘤。但由于一名患者在给药后发生外周血CD4+T细胞数目过低，该临床试验已暂停。
7.CD5
CD5是一种跨膜糖蛋白，在人类淋巴细胞的存活中起作用，同时也可以负性调节TCR信号的细胞成分。它表达于外周T细胞淋巴瘤，T细胞急性淋巴细胞白血病的肿瘤细胞表面，同时在正常的胸腺细胞，T细胞和B1细胞也有表达。Mamonkin等研究者设计了CD5重定向的CAR-T，并开展了针对复发难治T细胞白血病和淋巴瘤的临床研究。共纳入9名患者，3名患者出现1-2级CRS，4名患者取得ORR，3名为CR。结果表明CD5 CAR-T细胞能产生一定的临床疗效，并且不会导致完全的T细胞消除[5]。
8.CD7
CD7是来自Ig超家族的跨膜糖蛋白，通常在NK细胞和T淋巴细胞上表达，也表达于高度侵袭性的淋巴瘤或者白血病，主要包括：T淋巴母细胞性白血病/淋巴瘤，早期前T淋巴母细胞白血病，结外NK/T细胞淋巴瘤等。但肿瘤T细胞和正常T细胞均表达CD7，因此使用传统的制备工艺会使得CAR-T细胞间自相残杀，并破坏CAR-T产品的扩增。郑州大学的首个针对复发难治T淋巴白血病/淋巴瘤的CD7 CAR-T细胞的临床试验取得了良好的临床疗效。该产品将CD7靶向纳米抗体与内质网/高尔基体保留肽段重组融合，生成抗CD7蛋白表达阻断剂7PEBL，可诱导CD7在细胞内的滞留，从而预防CAR-T细胞自相残杀。试验共8例患者，5例达到CR，2例患者出现1-2级的CRS，未观察到神经毒性[6]。
二、CAR-T治疗面临的挑战
即使CAR-T疗法已开发出越来越多的靶点，在更多的疾病甚至实体瘤中展现了令人欣喜的效果，有着很高的缓解率，但是在临床中还是发现一些问题需要研究及解决。
1.抗原逃逸
目前认为，抗原逃逸是血液系统肿瘤患者CAR-T治疗后复发的主要原因。CD19 CAR-T的临床数据提示：CAR-T治疗后，10-20%的弥漫大B细胞淋巴瘤患者出现CD19阴性复发，并且直接影响细胞免疫治疗的疗效。抗原逃逸的机制可能为CD19基因突变或CD19剪接变异体使CD19分子失去了与CAR-T细胞表面结合的多肽[7, 8]。这类患者的进一步治疗只能选择更换靶点，但仍有复发的潜在可能。另外一部分抗原逃逸的患者复发时，仍能检测到靶点抗原表达，但水平显著低于CAR-T治疗前水平。而抗原密度达到一定的阈值是使CAR完全激活并充分发挥体内的杀伤活性必要条件[9-11]，抗原密度降低会影响患者对CAR-T治疗的反应质量。目前克服抗原密度降低的方法主要为同时使用增加靶抗原表达的药剂以及增强抗体的单链可变片段（scFv）对目标抗原的亲和力等。然而，这没有从根本上解决肿瘤抗原逃逸的问题，也导致了无法在治疗前对患者进行有效的筛查和预测。
2.CAR-T细胞衰竭
还有部分患者会出现靶点阳性的复发，可能的机制为CAR-T细胞在体内的有限生存和功能耗竭。当CAR-T细胞持续在体内暴露于肿瘤抗原时，CAR-T细胞会发生一系列表观遗传、代谢和转录改变，出现耗竭状态的表征。IL-2和TNF-α在早期丢失，IFN-γ和趋化因子逐渐减少，表现为CAR-T细胞功能丧失，同时表面的PD-1，TIM-3，LAG-3等抑制性受体的表达上调，抗肿瘤免疫反应被削弱。已有研究证明可以通过将CAR-T细胞与免疫检查点阻断疗法结合以进一步增强CAR-T抗肿瘤活性和持久性[12]，但仍有患者无法通过联合疗法获益。
3.免疫相关的不良反应
即使在反应率很高的CAR-T治疗临床试验中，患者也会发生严重的危及生命的事件，包括CRS，免疫效应细胞相关神经毒性综合征（ICANS）等。目前CRS和ICANS均有一定的分级标准。影响不良反应发生率和严重程度的因素包括CAR-T细胞的设计，肿瘤负荷，CAR-T细胞剂量，体内扩增情况和淋巴细胞消耗。CRS是由于回输的CAR-T细胞被广泛激活，从而导致大量细胞因子的释放。严重的情况下，患者会出现低血压，多器官功能衰竭甚至死亡。CRS被认为主要由IL-6介导，临床管理中使用托珠单抗和皮质类固醇来阻断IL-6受体，但仍有重度CRS和死亡的发生。CAR-T治疗后的ICANS也较为常见，患者主要表现为头痛，精神错乱，甚至脑水肿，昏迷或癫痫发作危及生命。而IL-6抑制剂通常对ICANS无效，临床管理主要使用皮质类固醇控制。
CRS分级
ICANS分级
来源：ASTCT ICANS consensus grading for adults (adapted from Lee et al/ASTCT, BBMT, 2019 75 )
三、CAR-T治疗未来方向
1.多靶点或序贯治疗
针对使用单一靶点CAR-T治疗后复发的患者，有研究采用多靶点CAR-T或者多个靶点CAR-T序贯输注的方法，以克服单一靶点治疗不能覆盖全部肿瘤，或者完全缓解后靶点抗原阴性的复发问题，从而提高CR率，延长持续完全缓解时间，甚至达到治愈。解放军总医院韩为东教授团队研发的Tandem CD19/CD20 CAR-T细胞疗法用于治疗复发难治性非霍奇金淋巴瘤。为评估其安全性和耐受性的一项临床研究表明，中位随访时间为19.1个月，28例患者ORR为79%，CR为71%。14%患者发生3级细胞因子释放综合征，未发现3级或更高水平的CAR-T细胞相关性脑病综合征[13]。
来自华中科技大学同济医学院附属同济医院的一项针对伴TP53突变的复发难治B细胞淋巴瘤患者的临床研究探讨了CD19 CAR-T和CD22 CAR-T细胞序贯输注的疗效和安全性。共有30例患者接受治疗，3个月ORR为60.0%，12个月PFS和OS分别为43.33%和45.33%[14]。另一项针对复发难治B细胞淋巴瘤患者的临床研究探讨了大剂量化疗联合自体造血干细胞移植后序贯输注CD19 CAR-T和CD22 CAR-T细胞的安全性和疗效。共42例患者接受治疗，ORR为90.5%，12个月的PFS率为85.7%，仅有5%的患者发生3级CRS和神经毒性[15]。这些研究说明了靶向多个靶点序贯治疗未增加毒副反应，同时有望提高CAR-T疗效。
2.CAR-T细胞改造
已有多项研究为提高CAR-T细胞的持久性和抗肿瘤能力，改善CAR-T细胞在体内失能或难以进入肿瘤的情况，而对CAR-T的结构进行改造。有研究将表达细胞因子的基因构建在CAR-T的结构中，使CAR-T细胞产生IL-15，或IL-18以参与先天性和内源性适应性免疫反应，使其更好地进入肿瘤[16, 17]。
为了促进CAR-T细胞向肿瘤的输送，可以使CAR-T细胞表达与特定肿瘤的趋化因子谱相匹配的趋化因子受体。例如，CCR2b的表达允许CAR-T细胞向表达CCL2的肿瘤迁移[18]。另外，TOX和NR4A转录因子的缺失以及AP-1家族转录因子c-Jun的过度表达可以增加小鼠肿瘤模型中CAR-T细胞的功能[19, 20]。
3.提高CAR-T疗法安全性
针对CAR-T回输后部分患者体内出现的严重CRS和ICANS，脱靶效应，肿瘤溶解综合征，如何进一步提高CAR-T在体内的可控性和安全性成为了关键的科学问题。研究发现酪氨酸激酶抑制剂达沙替尼可以通过干扰淋巴细胞特异性蛋白激酶（LCK）干扰CAR信号，诱导CAR-T细胞快速启动功能关闭状态，其抑制作用是迅速和完全可逆的，可作为CAR-T细胞毒性的潜在应急药物[21]。也有研究提出了另一种策略，使CAR-T细胞表面表达截断表皮生长因子受体（EGFRt），以便使用西妥昔单抗与CAR-T细胞结合，在必要的时机消除表达这些抗原的CAR-T细胞[22]，控制毒性。
尽管CAR-T细胞治疗近年来取得显著进展，已经彻底改变了血液系统恶性肿瘤的治疗，但目前仍存在诸多挑战，需要临床医生及科研人员共同合作，基于临床上的实际问题取得更多的突破，开发出效果更佳的产品，使CAR-T细胞治疗更高效，更可控，覆盖面更广泛，在血液肿瘤和实体瘤的治疗上展现独特实力。
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