武汉大学口腔医院口腔颌面-头颈肿瘤外科副教授，副主任医师
本硕博武汉大学毕业，博士后分别武汉大学物理学院赵兴中教授，美国北卡教堂山、加州大学洛杉矶分校顾臻教授（现浙江大学药学院）。
中国抗癌协会头颈整合委员会委员
湖北省颌面外科学会委员
主要专业领域为口腔颌面各类软、硬组织缺损修复重建，头颈鳞癌的肿瘤免疫分子机制及医工交叉仿生载药平台构建等。
目前主持国家省部级课题5项，发表SCI论文第一、共同第一以及通讯作者23篇，其中IF大于10分以上10篇，包括Journal of Dental Research、Signal Transduction and Targeted Therapy，Journal of Extracellular Vesicles，Angew Chem Inted、Advanced Functional Materials（2）、Small、Biomaterials、Journal of Nanobiotechnology（2）, Oncoimmunology（2），Nano Research，MedComm等专业领域顶级期刊，Google 学术总被引3300+，H指数32。
曾获2016年“邱蔚六口腔颌面外科希望奖”
2019年湖北省自然科学二等奖（3/5）
2020年全国口腔颌面-头颈肿瘤大会“最佳青年医师”奖,武汉大学 “朱裕璧医学奖”
武汉市中青年医学骨干人才等
摘要:嵌合抗原受体T细胞疗法（chimeric antigen receptor T , CAR-T）在血液系统恶性肿瘤的免疫治疗中展现出的出色效果，为其在实体瘤中的应用提供了研究思路。早在2006年CAR-T细胞疗法在卵巢癌中的运用就已经进入临床试验阶段，然而，其包括头颈部鳞癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）在内的实体瘤中的抗瘤效果依旧不尽人意，其治疗的靶点选择性低、肿瘤渗透效果差、体内存活时间短、潜在毒性作用强都是研究者亟待解决的问题。本文就CAR-T细胞疗法在HNSCC中的研究及应用展开综述，以HNSCC为中心，介绍CAR-T细胞疗法的基本概况及现在在实体瘤治疗中面临的挑战和解决方法。
关键词：嵌合抗原受体T细胞疗法；免疫治疗；实体瘤；HNSCC
1. 背景
头颈部鳞状细胞癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSCC）是包括口腔、鼻、咽、喉等部位在内的头颈部黏膜上皮组织的恶性病变，约占头颈部恶性肿瘤的90%。作为世界第六大高发癌症，头颈部鳞癌全球范围内每年的新发病例大约为80万人，死亡人数可达40万人[1-3]。头颈部鳞癌的发病高危因素呈现明显的地域差异性，烟草酒精的过度使用以及咀嚼槟榔是亚洲尤其是南亚、东南亚各国以及中国湖南、台湾及海南地区在内的常见致病因素，而在欧美国家HPV病毒感染已经逐渐成为其发病的高危因素[4-7]。现如今，对于头颈部鳞癌的治疗根据疾病分期的不同有不同的治疗手段，但是以手术切除病灶为主结合放化疗的多学科综合序列治疗依旧是头颈部鳞癌的主要治疗手段。尽管目前的治疗手段已经有了长足的进步，近40年来头颈部鳞癌患者的生存率依旧仅为50%-66%[1-3]。同时，HNSCC的发病区域集中在患者口腔颌面头颈部，其治疗严重影响患者的进食、说话、工作等日常及社交生活，降低患者生存质量，增加患者的心理负担，有研究表明，该病幸存患者的自杀率在全部癌症患者中仅次于胰腺癌，甚至高于肺癌而排第二位[8]。因此，如何有效提升HNSCC的治疗效果及患者生存质量正日益成为现今研究焦点。
对于包括肿瘤疫苗、过继性免疫细胞疗法以及免疫检查点阻断在内的免疫治疗，在最近的临床前实验以及临床试验中表现出不菲的潜力[9-12]。其中嵌合抗原受体T细胞疗法（chimeric antigen receptor T , CAR-T），是一种新型的免疫治疗手段，通过基因工程手段使患者体内的T淋巴细胞表达肿瘤抗体以MHC非依赖的方式特异性识别并杀伤肿瘤细胞。CAR-T细胞疗法的概念早在上世纪80年代末就已经被提出，通过30年的研究已经发展至第4代，并且在血液系统恶性肿瘤的治疗发面取得了突破性成就[13, 14]（图一）。多个临床试验验证了抗CD19的CAR-T细胞疗法的安全性及效果，目前已经有5种CAR-T细胞药物被美国食品药品监督管理局（US Food and Drug Administration, FDA）批准上市，用于血液系统恶性疾病的治疗。其中诺华公司的tisagenlecleucel（Kymriah）于2017年八月被FDA批准成为第一个用以治疗儿童及青年B细胞淋巴细胞白血病，开启了CAR-T细胞疗法元年。
Figure 1: Timeline of CAR-T cell therapy. In 1989, Gross G et al. first reported chimeric antigen receptor T cell which can specifically recognize tumor surface antigens in a non-MHC restricted manner. In the following years, a total of 4 generations of CAR-T cells were developed and reported. In 2012, Carl June and co-workers successfully cured a patient with acute B-cell lymphoblastic leukemia using CAR-T cell therapy. Now the patient has survived tumor-free for 9 years. CAR-T cell therapy for solid tumors including HNSCC has also been reported in recent years. Maher J and co-workers demonstrated EGFR as one of the targets of HNSCC therapy. In 2017, two CAR-T cell productions targeting CD19, Kymriah and Yescarta, were approved by the FDA for the treatment of hematological malignancies. Subsequently, three more CAR-T cell productions were approved by the FDA. FKC876, the first CAR-T cell production in China, was approved.
据报道，在75个儿童和青年患者中进行的临床试验，使用tisagenlecleucel治疗的患者3个月内总体缓解率达到81%且12个月存活率为76%，第一位接受CAR-T细胞疗法的儿童患者Emily已经成功无瘤生存近9年之久，然而部分受试者中出现的细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome, CRS）（发生率可达77%）以及神经毒性等不良反应导致CAR-T细胞疗法临床运用受限，因此降低CAR-T细胞疗法的不良反应依旧是后续改进药物的重点内容[15-17]。在后续的临床试验可知， tisagenlecleucel治疗CD19阳性成人复发性或难治性弥漫性大B细胞淋巴瘤的2期临床试验中其缓解率率可达52%，且无不可逆性毒副作用发生，同时使用高剂量分级的给药方式可以在不影响疗效的前提下（90%完全缓解率）大大减少使用CAR-T细胞疗法的不良事件（4/5级CRS发生率为5%，Penn grading scale标准）[18, 19]。除此之外，KITE公司的axicabtageneciloleucel（Yescarta，2017）在治疗复发或难治性大B细胞淋巴瘤的2期临床试验中，患者缓解率可达82%，在2年的随访中患者出现3级及以上CRS及神经毒性的概率为11%和32%验证其长期安全性[20, 21]，随后同公司产品brexucabtageneautoleucel（Tecartus）于2020年被FDA批准用于复发性或难治性套细胞淋巴瘤的治疗。2021年由Juno Therapeutics公司研发的lisocabtagenemaraleucel（Breyanzi）以及由百时美施贵宝和蓝鸟联合开发的以B细胞成熟抗原（B-cell maturation antigen, BCMA）为靶点的CAR-T细胞idecabtagenevicleucel（Abecma）分别用以治疗复发或难治性大B细胞淋巴瘤以及复发或难治性多发性骨髓瘤成为第四及第五个FDA批准的CAR-T细胞产品。由于CAR-T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤治疗中的出色作用，其在包括头颈部鳞癌的实体肿瘤中的治疗作用也成为当下研究的重点。本文对CAR-T细胞常见作用靶点、HNSCC中的研究进展及当前CAR-T细胞疗法在实体瘤中运用障碍展开综述，探讨CAR-T细胞在包括HNSCC在内的实体瘤中运用的机遇和挑战。
2.CAR-T细胞结构、作用原理及安全性
CAR-T细胞的合成主要是通过基因工程技术对患者自体T细胞进行改造，其过程主要包含以下三个步骤：1、通过白细胞分离、单核细胞淘洗和T细胞分选的方式对患者的T细胞进行收集；2、通过激活分离出的T细胞并使用编码特定的嵌合抗原受体（CAR）的病毒载体的方式对其进行转基因转导；3、对完成转基因递送的T细胞进行扩增，并将增殖后的CAR-T细胞输送入患者体内以达到靶向杀伤肿瘤细胞的作用[22] （图二）。
Figure 2：Schematic of CAR-T cell synthesis. Cells are separated and collected by leukapheresis, monocyte elutriation and T-cell selection. The isolated T cells are transduced to express CAR proteins through genetic engineering. After transgene delivery, CAR-T cells are expended in vitro and transported into the patients.
CAR-T细胞包括T细胞及其可以特异性识别肿瘤细胞的CAR等结构。其中CAR的胞外单链抗体（single-chain variable fragment, scFv）来源于抗体蛋白，由轻链可变区（VL）及重链可变区（VH）构成并且连接于跨膜结构，用以特异性识别肿瘤相关抗原（tumor associated antigen，TAA）。CAR在T细胞内部的结构为CD3ζ等构成的信号转导段，它可以通过T细胞受体非依赖的方式介导T细胞的活化[14]。随着CAR-T细胞研究的深入，根据不同的胞内结构将CAR-T细胞分为了四代。在第二代三代CAR-T细胞中，CAR的胞内结构增加了CD28或（和）4-1BB等共刺激区域用以促进T细胞的增殖以及其体内存活率。近期，研究者报道了第四代CAR-T细胞，与前几代不同的是第四代CAR-T细胞可以释放IL-12、IL-8、IL-9等细胞因子，从而在增强T细胞活性、抗肿瘤免疫应答及体内存活时间的同时更加精确地控制毒性细胞因子的释放[22-26]。部分报道介绍了“第五代”CAR-T细胞，即通用型CAR-T细胞。该CAR系统拆分了T细胞信号结构及靶向抗原的结构以达到识别更多靶蛋白的目的，提高CAR-T细胞对于不同癌症治疗的灵活性[27]。（图三）。与传统免疫治疗相比，CAR-T细胞疗法中与肿瘤细胞的识别不依赖MHC分子，从而减少了由于肿瘤细胞低表达MHC分子造成的低免疫原性所带来的免疫逃逸的影响。同时，CAR可以促进T细胞的活化及抗肿瘤免疫应答作用，并且有可控性较强的优势[28]。
Figure 3：Schematic of four generations of CAR-T cell. CAR is composed of single-chain variable fragment, transmembrane domain, and signal domain. The signal domain of first-generation CAR-T cell is typically composed of CD3ζ signal chain. In second- or third-generation CAR-T cell, structure of signal domain contains co-stimulatory domains such as CD28 or (and) 4-1BB. The fourth-generation CAR-T cell is engineered to equip with nuclear factor and express cytokines. The structure of CAR-T cells is still improving, and the development of fifth-generation CAR-T cell is inevitable.
然而，Satpathy AT及共事者通过单细胞转录组测序分析指出人血脑屏障细胞及脑部细胞中存在CD19的表达，靶向CD19的CAR-T细胞在杀伤肿瘤细胞的同时也会靶向血脑屏障细胞从而导致神经毒性[29]。CAR-T细胞治疗会引起一系列免疫病理反应，如CRS、肿瘤溶解综合征（tumor lysissyndrome, TLS）及脱靶毒性（On-target off-tumor toxicity）等引起的患者发热、低血压、缺氧、神经毒性、皮肤毒性、胃肠毒性及多器官损伤，严重时可导致患者死亡，从而影响CAR-T细胞疗法的应用场景[13, 30, 31]。对于CRS的分级目前包括CTCAE4.0.标准、MD Anderson癌症中心/Lee分级、Penn grading scale标准等。其中，患者在接受CAR-T细胞治疗后常使用Penn grading scale标准对CAR-T细胞疗法不良反应中最常见CRS进行分级：CRS1级为需要接受退热及止吐治疗的轻度反应；CRS2级为患者出现功能失调，需要入院治疗以消除CRS带来的不良症状；CRS3级为更严重的器官功能失调反应，需要入院及为CRS相关症状提供包括鼻导管给氧、低剂量升压药物等支持治疗；CRS4级反应可严重危及生命，需要包括高剂量升压药及机械通气在内的支持治疗以维持生命；CRS5级反应会导致患者死亡[32]。因此，探索消除这些免疫病理反应的方法正日益成为如今CAR-T细胞疗法研究的热点。
3. CAR-T细胞疗法在实体瘤中的应用
CAR-T细胞疗法的核心之一即肿瘤相关靶点的选择，合适的CAR-T细胞靶点是CAR-T细胞在实体瘤中运用的基石，其在提高抑瘤作用效能的同时可降低CAR-T细胞疗法不良反应程度。下文介绍了多种常见的靶蛋白以及靶向这些靶点的CAR-T细胞疗法在临床试验中的效能及安全性，同时探索了临床前研究中其他最新靶点的研究进展（表1）。
3.1 EGFR作为CAR-T细胞治疗靶点
表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）作为受体酪氨酸激酶在肺癌中过度表达，其抑制剂是第一个被用于肺癌治疗的药物[33]。Han W及共事者的临床研究证实了抗EGFR的CAR-T细胞对治疗非小细胞肺癌（NCT01869166）、转移胰腺癌（NCT01869166）的安全性以及对癌症的控制：非小细胞肺癌11位受试者中仅有一人出现3-4级的血清脂肪酶升高，且在治疗后2-8个月2位患者出现部分缓解、5位患者病情稳定；而在16位转移胰腺癌患者中数位患者出现3级以上不良反应（CTCAE4.0.标准）无不可逆性不良反应及治疗相关死亡出现，且除去2位失联患者剩余14位患者的客观缓解率为28.6%、疾病控制率可达85.7%，但是患者生存率没有明显改善（试验组总生存时间为4.9个月，而该病的平均总生存期为2.3至10.3个月）[34, 35]。有研究表明表皮生长因子受体变体Ⅲ（EGFR variant Ⅲ，EGFRvⅢ）作为一个肿瘤限制性抗原在30-40%的胶质细胞瘤中表达，并且不在正常组织中表达[36]。O'Rourke DM等人于2017年报道了靶向EGFRvⅢ的CAR-T细胞用来治疗复发性胶质母细胞瘤的I期临床试验（NCT02209376），10位试验中受试者未出现剂量限制性毒性及全身CRS等不良反应，但是一位患者出现了癫痫症状可能与局部T细胞活化及颅内细胞因子释放有关。患者中位存活时间为251天，且1位受试者在接受治疗后18个月仍然存活[37]。同时，Wang S等人在2019年的临床试验中证实相比于传统核磁共振成像使用多参数核磁共振成像（multiparametric magnetic resonance imaging,mpMRI）可以显示病灶的进展以及对治疗的应答从而更准确地对EGFRvⅢ-CAR-T细胞疗法治疗复发性胶质母细胞瘤的疗效进行表征[38]。除此之外，以EGFR及EGFRvⅢ为靶点的CAR-T细胞用于治疗转移性结直肠癌（NCT03542799）、肺癌（NCT04153799）、乳腺癌/胶质母细胞瘤（NCT01454596）等的临床试验依旧在继续以验证其疗效及安全性。
3.2 HER2作为CAR-T细胞治疗靶点
人类上皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2, HER2）属于EGFR蛋白家族，其过度表达被证实发生在多种癌症中并与肿瘤的发展、转移以及不良预后相关，被认为是免疫疗法治疗包括胶质细胞瘤、卵巢癌、乳腺癌、消化系统癌等恶性疾病中的重要靶点[39-42]。Ahmed N等人于2015年及2017年进行临床试验探索HER2-CAR-T细胞疗法在治疗HER2阳性肉瘤（NCT00902044）及胶质母细胞瘤（NCT01109095）中的安全性及有效性，两种肿瘤患者在接受CAR-T细胞治疗后的平均生存时间分别可达10.3及11.1个月，且CAR-T细胞在两中肿瘤患者使用的最高剂量被证明安全，没有达到剂量限制性毒性[43, 44]。Feng K等人2018年的临床试验（NCT01935843）中报道了靶向HER2的CAR-T细胞疗法在11位胆管癌以及胰腺癌患者的治疗，其中1人病情部分缓解、5人病情稳定，平均无进展生存时间为4.8个月，且无严重CRS发生且相关毒性均在可控范围内，提示靶向HER2的CAR-T细胞治疗的安全性以及可行性[45]。
3.3 IL13Rα2作为CAR-T细胞治疗靶点
据报道IL13Rα2在75%的胶质母细胞瘤中表达并与其侵袭以及不良预后密切相关[46]。Brown CE等人于2015年首次进行了靶向胶质母细胞瘤抗原IL13Rα2的CAR-T细胞用于复发性胶质母细胞瘤治疗的临床试验（NCT00730613），其中3名受试者中在接受最大剂量的CAR-T细胞时出现两例3级头疼及1例3级包括步态蹒跚、舌头偏斜在内神级症状的不良反应，受试者肿瘤IL13Rα2表达减少且有2名受试者肿瘤无复发。除此之外，Brown CE等人还于2016年报道（NCT02208362）一位患有复发性胶质母细胞瘤的患者接受CAR-T细胞治疗后的情况：患者通过心室内注射及腹膜腔注射两种方式接受CAR-T细胞治疗，无3级以上不良反应发生，在使用CAR-T细胞治疗190天后颅内及脊髓肿瘤大小减小可达77%-100%，且临床缓解时间可达7.5个月，上述实验均提示抗IL13Rα2的CAR-T细胞对于胶质母细胞瘤有较强的抗瘤作用[47, 48]。
3.4 MSLN作为CAR-T细胞治疗靶点
间皮素（Mesothelin，MSLN）是一种肿瘤分化抗原，在正常组织中表达水平较低但是在包括胰腺癌在内的多种实体瘤细胞中高表达。由于其选择性表达的特征以及对肿瘤发生发展的影响，MSLN被认为是治疗胰腺癌的潜在靶点[49]。June CH及同事的两个I期临床试验（NCT01355965、NCT01897415）报道了来源于鼠中的靶向MSLN的抗体合成CAR-T细胞用于恶性胸膜间皮瘤及胰腺癌患者的治疗，除其中一位受试者在进行第三次注射后出现过敏反应和心脏停搏等不良反应外其余患者表现出对CAR-T细胞治疗的耐受性，一位患者经过CAR-T细胞治疗病情部分缓解，另一位病人肿瘤减小40%，提示来源于鼠的抗体合成的CAR-T细胞对于实体瘤治疗的安全性及抗瘤效能，同时其潜在免疫源性可能会导致CAR-T细胞治疗的安全问题[50, 51]。在后续的临床试验中June CH及同事使用靶向MSLN的CAR-T细胞对6例化疗难治性胰腺导管腺癌患者进行治疗，无患者出现CRS及剂量限制性毒性,其中3位患者癌症代谢活跃量稳定1位患者甚至减少69.2%，2位患者的无进展生存时间分别是3.8及5.4个月[52]。June CH及同事的试验证明了靶向MSLN蛋白的CAR-T细胞在不同实体瘤中运用的安全性及抗瘤作用。
3.5其他靶点
除前文介绍的用于临床试验的肿瘤细胞抗原靶点外，最新的临床前研究及临床试验也提出了其他CAR-T细胞在实体瘤的治疗中的作用靶点。靶向CD70和免疫检查点分子B7-H3（B7 homolog 3 protein）的串联CAR-T细胞被证明有抑制黑色素瘤、肺癌及其他实体瘤的作用，在肺癌及黑色素瘤的小鼠模型中相比于对照组小鼠在40天左右全部死亡，高剂量用药后75天小鼠的存活率可分别达50%及37.5% [53]。靶向神经节苷酯G2（gangliosides D2，GD2）的CAR-T细胞对于神经母细胞瘤有抑制作用，其相关临床试验（NCT03294954）验证靶向GD2的自然杀伤T细胞对治疗复发或难治性神经母细胞瘤治疗的安全性及有效性。药物被证明无剂量限制性毒性，三位受试者中一位患者病情稳定，两位患者出现部分缓解，其中一位患者远处骨转移病灶减小[54, 55]。Petrausch U及其共事者验证了靶向成纤维细胞活化蛋白（Fibroblast activation protein, FAP）的CAR-T细胞用于恶性胸膜间皮瘤模型小鼠治疗的有效性，在使用抗FAP CAR-T细胞治疗后小鼠存活率为90.9%,高于靶向纽约食管鳞状细胞癌1（NY-ESO-1）的CAR-T细胞对照组（18.2%）（p=0.007）。在后续的实验中，该团队发现联合阻断PD-1及使用靶向FAP含有Δ-CD28共刺激结构的CAR-T细胞在治疗恶性胸膜间皮瘤模型小鼠25天后小鼠的存活率（81.8%）远高于含有4-1BB及CD28共刺激结构的对照组（45.5%）（p<0.001）。同时，包含不同共刺激域的靶向FAP的CAR-T细胞对于该病的治疗也进入了临床试验阶段，试验表明患者病情在接受含有缺乏淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶结合区域的CD28共刺激因子的抗FAP-CAR-T细胞治疗的1年内保持稳定[56, 57]。CD19作为血液性恶性疾病中常用的靶蛋白，其在实体瘤中的运用也在研究阶段：Wu L及共事者使用FLAG标记的CD19-CAR-T细胞治疗CD19阳性的海拉细胞系小鼠模型，研究发现使用FLAG标记的CD19-CAR-T细胞治疗组处理33天后的肿瘤大小为285 mm³远低于未转导T细胞对照组处理19天后的935mm³（p<0.05）[58]。除此之外，Gautam SK等人论述了MUC4作为CAR-T疗法治疗胰腺癌的重要靶点的应用前景[59]。最近，Schäfer D 等人通过流式细胞筛选、免疫荧光等研究将CD318、TSPAN8和CD66c定义为CAR-T细胞治疗胰腺管癌的潜在靶点[60]。
4.CAR-T细胞疗法在HNSCC中的运用
CAR-T细胞疗法在实体瘤中的研究正在逐步深入，而HNSCC作为严重影响患者生活的实体瘤，其CAR-T细胞疗法的研究仍主要为临床前研究阶段，新靶点的选择、不良反应的消除都是目前在HNSCC的治疗中CAR-T细胞疗法从临床前研究进入临床试验阶段面临的难题。
4.1 临床前研究
HNSCC作为常见的实体瘤，其免疫治疗也是当今研究的重点。靶向HER2分子的CAR-T细胞在治疗HNSCC上已经有较多临床前研究并进入了临床试验阶段，然而单独靶向HER2蛋白的CAR-T细胞在免疫抑制的肿瘤微环境下治疗实体瘤的能力仍有待提高[61, 62]，因此Rosewell Shaw A等人探索了使用腺病毒治疗结合CAR-T细胞疗法以提高抗肿瘤效果的新方法。溶瘤病毒（oncolytic viruses，OVs）能够特异性靶向肿瘤细胞并在局部溶解肿瘤细胞，通过基因工程技术还可使其表达转基因以增强自身细胞毒性及对包括CAR-T细胞疗法在内的其他免疫疗法的协同作用[63]。研究者通过基因工程创造出可以表达细胞程序性死亡配体1（programmed cell death 1 ligand 1, PD-L1）阻断抗体以及细胞因子的二元溶瘤腺病毒（binary oncolytic adenovirus , CAd）联合CAR-T细胞用于实体瘤的治疗。研究发现CAd与HER2-CAR-T细胞结合使用在注射3天后HER2-CAR-T细胞可在原位肿瘤及转移病灶处被发现，用药后120天小鼠存活率为100%（单独使用抗HER2的CAR-T细胞小鼠在50天时全部死亡）（p < 0.003），并且在用药后60天小鼠体重无明显变化，表明CAd加强了HER2-CAR-T细胞对于治疗原位及远处转移的HNSCC的抑癌作用及安全性[64]。除此之外，Dong YH等人的临床前研究证实了在HNSCC细胞系中孵化抗EGFR-CAR-T细胞后细胞因子的释放明显增加，且靶细胞溶解率高达52.66%（对照组仅约为15%）[65]。Park YP等人对HNSCC细胞的9个免疫靶点进行分析证明抗CD70的CAR-T细胞对于CD70阳性HNSCC细胞的识别作用及细胞毒性，体外实验中CD70-CAR-T细胞对两个细胞系的HNSCC( OQ01 / CAL27)杀伤作用明显（p<0.005）[66]。HNSCC细胞表面高表达的MUC1也成为靶向HNSCC的CAR-T细胞治疗研究方向，Mei Z等人选择了MUCI作为CAR-T细胞的靶点同时通过基因工程使CAR-T细胞释放IL-22以增加T细胞功能，研究发现加入IL-22释放的四代CAR-T细胞在MUC1阳性HNSCC的小鼠模型中表现出出色的抗肿瘤效果，免疫荧光显示CAR-MUC1-IL22 T细胞组肿瘤组织中CD3+T细胞数量明显上升且肿瘤的发展明显慢于对照组(肿瘤大小约仅为未处理组的7/100，p<0.001)[67]。作为透明质酸受体CD44的异构体，CD44v6（CD44 variant 6）在包括HNSCC在内的多种实体瘤细胞表面高表达。Haist C等人报道了靶向CD44v6的CAR-T细胞对于CD44v6阳性的多个HNSCC细胞系（UM-14C、UM-10B等）的杀伤效果，CAR-T细胞对于肿瘤细胞的杀伤效果表现出明显的CD44v6表达水平依赖性，当CD44v6-CAR-T细胞与靶细胞的比例为3：1与UM-14C细胞系细胞共孵育16小时后，肿瘤细胞的清除率可达80%，远高于比例为0.3：1的CD44v6-CAR-T细胞及比例为3：1的CD19靶向CAR-T的对照组清除率（30%，5%）[68]。Scribner JA等人的临床前研究表明CAR-T细胞治疗中靶向B7-H3的抗体MGC108在包括HNSCC在内的小鼠实体瘤模型中发挥了抑癌作用，相对于未治疗组肿瘤体积的减小可达98%，提供了CAR-T细胞治疗HNSCC的新思路[69]。实体瘤中癌症干细胞对放疗的抵抗成为导致肿瘤转移复发的重要因素，Arndt C等人实验指出靶向CD98或EGFR的通用嵌合抗原受体（universal chimeric antigen receptor ，UniCAR）T细胞对于放疗抵抗的HNSCC细胞存在杀伤作用以及在小鼠模型体内实验中使用后显著减少放疗抵抗肿瘤细胞数量。靶向CD28及EGFR的UniCAR-T细胞分别治疗人舌鳞癌模型小鼠80小时后，肿瘤大小均低于原来的25%（p < 0.0021，p < 0.0332），而未做处理组的大小为原来的175%（p < 0.0002），同时不伴有小鼠体重的降低[70-72]。
4.2 临床试验
在专业的临床试验登记网站https://clinicaltrials.gov/及中国临床试验注册中心网站http://www.chictr.org.cn/对CAR-T细胞疗法在HNSCC中的运用进行搜索的结果显示其相关临床试验并不丰富。John Maher等人于2013年在网站发布的一期临床试验用以验证向肿瘤部位直接注射靶向ERBb蛋白的CAR-T细胞（T1E28z）对于传统治疗无效HNSCC患者的安全性和有效性（NCT01818323），并于2018年完成该临床试验。试验结果显示，13名受试患者均未出现2级以上不良事件及剂量限制性毒性（CTCAE v4.0标准），并且患者疾病总控制率可达69%[73, 74]。Daniel Wang等人于2018年在网站上发布了关于HNSCC治疗的一期临床试验的招募通知，用以测试靶向HER2蛋白的CAR-T细胞疗法结合溶瘤病毒CAdVEC针对HER2阳性包括HNSCC的多种癌症中的安全性和有效性（NCT03740256）。除此之外，CAR-T细胞靶向上皮细胞粘附分子（Epithelial cell adhesion molecule, EpCAM）、自然杀伤细胞2族成员D配体（Natural killer group 2, member D ligand, NKG2DL）、潜伏膜蛋白（latent membrane protein1, LMP1）治疗鼻咽癌（NCT02915445、 NCT04107142、NCT02980315）的安全性和有效性的临床试验也仍在进行中。
4.3 CAR-T细胞治疗HNSCC的潜在靶点
除了上述进行临床前研究及临床试验的HER2、CD70、EGFR、MUC1、B7-H3等治疗HNSCC的靶点蛋白外，寻找HNSCC新的特异性靶点以增加CAR-T细胞的覆盖范围及减少其毒副作用也是促进CAR-T细胞疗法进入临床应用的手段之一。对于治疗HNSCC的CAR-T细胞目标靶点的选择通常以：1.实体瘤治疗中常见的CAR-T细胞靶蛋白；2. HNSCC细胞表面高表达的蛋白为条件进行筛选。据报道，在18种常见CAR-T细胞靶蛋白中，除了上文介绍的靶蛋白外，和对照的正常组织相比MHCⅠ类分子相关蛋白A(MHC class I chain-related gene A, MICA)、MHCⅠ类分子相关蛋白B(MHC class I chain-related gene B, MICB)、黑色素瘤相关抗原4(Melanoma-associated antigen 4, MAGEA-4)、FAP、EPCAM、β-1,4-N-乙酰半乳糖胺基转移酶1 (Beta-1,4-N-Acetyl-Galactosaminyltransferase 1, β4GALNT1) 蛋白在HNSCC细胞表面的表达水平也显著提升[66]。上述实验为HNSCC中CAR-T细胞新靶点的选择提供思路，即在对HNSCC肿瘤特异性表面抗原进行研究的同时，研究者也要密切关注CAR-T细胞在其他实体瘤中的抗原以寻找到安全可行的CAR-T细胞作用靶点。
5. CAR-T细胞疗法在实体瘤中运用的障碍及解决方法
虽然上述内容介绍了CAR-T细胞治疗在实体瘤中的临床前研究及临床试验，但是实体瘤相比于血液性疾病，其独特的肿瘤微环境促进了包括紧凑的肿瘤结构、肿瘤基质细胞等在内的物理屏障；包括细胞因子含量下调、微环境酸性低氧缺乏营养物质等在内的生理屏障以及包括免疫抑制剂细胞、免疫检查点、肿瘤抗原缺失等在内的生化屏障作用，限制了CAR-T细胞对于实体瘤渗透运输作用、CAR-T细胞增殖及杀伤肿瘤细胞功能、靶向实体瘤的特异性。因此解决CAR-T细胞疗法在实体瘤中的运用障碍便成为其进入实体瘤治疗的临床运用之路上最重要的一步。下文我们将从CAR-T细胞在实体瘤中运用的运输及功能阻碍及其安全性问题展开介绍（表3）。
5.1 CAR-T细胞在实体瘤中的运输阻碍
CAR-T细胞发挥作用的基础是运输至肿瘤病灶处并且在此聚集。然而相比于血液性肿瘤来说，由于肿瘤细胞外基质中致密的纤维结构和促血管生成因子的过度表达所致的血管再生等物理屏障作用，以及肿瘤细胞趋化因子表达水平较低或是表达的为T细胞不匹配的趋化因子都会导致的T细胞向肿瘤处的迁移受阻[75-78]。为了解决CAR-T细胞靶向肿瘤细胞运输的阻碍，提高其运输效率，以下三类改善CAR-T细胞疗法的方案被提出：1.CAR-T细胞向实体瘤递药的方式改变。除了通过静脉注射途径向患者体内输送CAR-T细胞外，多篇实验报道了采用肿瘤内注射CAR-T细胞的方式以治疗包括肝癌、胶质母细胞瘤和乳腺癌等在内的多种实体瘤，有效地增加了CAR-T细胞在肿瘤病灶部位的富集含量的同时减少了其对于正常组织细胞的细胞毒性[79-81]。此外，据研究发现，由藻酸盐和胶原模拟多肽合成的生物聚合物3D支架以及镍钛合金薄膜支架可以促进T细胞在肿瘤微环境中的迁移并增强了T细胞的存活时间及抗瘤效果：藻酸盐支架在处理的12天后T细胞信号依旧维持较高水平而通过腹膜给药对照组在12天后无T细胞信号（p<0.0001）；在使用金属支架的小鼠在100天的存活率可达70%，而局部注射CAR-T细胞的小鼠在70天时全部死亡（p<0.0001）[82, 83]。2.CAR-T疗法与其他抗肿瘤疗法结合。 Chen Q等人通过CAR-T结合光热治疗（photothermal therapy, PTT）的方式，使用PTT减少了肿瘤血管内皮的物理屏障作用、促进CAR-T细胞在肿瘤部位的迁移和聚集的同时还可以破坏肿瘤细胞及细胞外基质，从而增加了肿瘤部位IL-2、IFN-γ等细胞因子的含量以及CAR-T细胞的肿瘤杀伤效率。体内实验数据显示：PTT结合CAR-T细胞对黑色素瘤模型小鼠进行治疗20后肿瘤尺寸小于100mm³，远低于未做处理组的1000mm³（p<0.001）[84]。3.通过基因工程改进CAR-T细胞。乙酰肝素酶（HPSE）在新鲜的T细胞中常见但是在体外培养的CAR-T细胞中表达减少，它可以降解肿瘤细胞外基质主要成分硫酸乙酰肝素蛋白多糖从而促进T细胞向肿瘤部位的转移[85]。Caruana I等人的研究发现通过基因工程表达HPSE可以使CAR-T细胞表现出更强的抗肿瘤活性，体内实验中释放HPSE的CAR-T细胞处理神经母细胞瘤小鼠模型50天后的小鼠存活率（57.1%）相对于不释放HPSE的CAR-T对照组（9.5%）存在明显改善（p=0.0006）[86]。通过基因工程使CAR-T细胞表达趋化因子受体以识别肿瘤细胞所表达的趋化因子也成为增加CAR-T细胞靶向运输的方式之一。Jin L等人的研究表明，在成胶质细胞瘤小鼠模型中，CXCR1及CXCR2的表达可以显著增强CAR-T细胞的迁移（注射2天后可见大量CAR-T细胞迁移至肿瘤部位）同时增强其抗瘤效果：在注射80天后小鼠的存活率为100%，而对照组CAR-T细胞治疗80天后小鼠的存活率仅为50%（p<0.05）[24]。
5.2 CAR-T细胞在实体瘤中的功能阻碍
除了实体瘤对CAR-T细胞迁移方面的屏障作用外，实体瘤中的遗传异质性以及可供选择的靶点有限，导致的传统的CAR-T细胞治疗存在肿瘤逃逸现象。为了增加T细胞应答及肿瘤细胞的清除率，研究者开始进行多靶点CAR-T细胞疗法实验。Li T等人使用靶向HER2和IL13Rα2靶点的串联型双特异性抗体CAR-T细胞治疗胶质母细胞瘤，证明了其减少肿瘤抗原逃逸增加抗肿瘤的效果，使用串联型CAR-T细胞治疗成胶质细胞瘤模型小鼠中位无进展生存时间可达36天（P =0.0007），而使用HER CAR-T细胞或IL13Rα2 CAR-T细胞治疗后小鼠中位无进展生存时间仅为14天（P <0.04）[87]。Cho JH等人介绍了“分离、通用和可编程”（split, universal, and programmable，SUPRA）CAR系统，可以在不再进行T细胞基因工程的情况下改变CAR-T细胞作用靶点从而实现可调控的抗肿瘤效果。在HER2阳性乳腺癌模型小鼠的体内实验中，在41天时使用体内成像观察小鼠的肿瘤荧光强度可见联合使用RR zipCAR及α-Her2-EE zipFv后小鼠肿瘤荧光强度约为仅使用RR zipCAR的1/100(p ≤0.001)。除了可观的抗瘤效果外，SUPRA CAR系统可以实现可控的细胞因子释放、T细胞活性的“开关”控制及不同靶蛋白的切换，从而有效减少CRS的发生，增加其安全性及作用效果。[88]。Park AK等人通过CD19靶向CAR-T细胞与溶瘤病毒结合的方式提高CAR-T细胞疗法靶向及消除实体瘤的能力：前文介绍了溶瘤病毒其特异性靶向肿瘤细胞的特性，研究者通过基因工程使溶瘤病毒（OV19t）在进入肿瘤细胞后复制自身的同时还能够使肿瘤细胞表面表达截短的CD19蛋白，为CD19靶向CAR-T细胞传递了作用靶点。在结肠癌模型小鼠中联合使用CD19-CAR-T细胞和OV19t后小鼠完全缓解率可达56%而仅使用CAR-T细胞疗法的完全缓解率为0%，提示该发现在扩大CAR-T细胞疗法运用范围增强其疗效方面有惊人的潜力[89]。
除此之外，实体瘤肿瘤微环境以及免疫逃逸的特征也会对CAR-T细胞产生不利影响——实体瘤的肿瘤微环境呈现出酸性、低氧、缺乏营养物质以及肿瘤细胞表面表达免疫检查点会导致肿瘤免疫逃逸从而抑制免疫细胞靶向肿瘤细胞的能力[90-92]。因此通过基因工程使CAR-T细胞表达细胞因子以改变免疫抑制的肿瘤微环境成为增加CAR-T细胞活性的新选择。自分泌IL-12的CAR-T细胞被证实在卵巢癌的治疗中可以减少肿瘤相关巨噬细胞数量、克服PD-L1带来的免疫抑制，有促进CAR-T细胞的增殖、增加细胞毒性并且抑制其凋亡的作用：在体内实验中，使用4H1128ζ-IL12 CAR-T细胞处理卵巢癌模型小鼠48小时后小鼠的癌细胞数量（8.45%）相比于4H1128ζ CAR-T细胞治疗（14.06%）可见减少（p < 0.001），现已经进入临床试验阶段[93]。IL-23可以促进记忆T细胞和辅助T细胞的增殖，有研究表明表达p40以促进IL-23分泌的CAR-T细胞抗颗粒酶B增加、PD-1水平减少导致其抗肿瘤效力增加：在小鼠神经母细胞瘤及胰腺癌的模型中，使用表达IL-23的CAR-T细胞疗法出现第一只小鼠死亡的时间约分别为30天及50天后，而不表达IL-23的对照组出现第一只小鼠死亡的时间约分别为20天及30天后[94]。Adachi K等人的研究表明通过基因工程分泌IL-7和CCL19的CAR-T细胞联合环磷酰胺治疗，相比与传统CAR-T细胞而言，可以增加其靶向肿瘤的能力及其在实体瘤中的作用时间，体内实验中小鼠在140天的存活率为100%且无肿瘤复发[95]。通过基因工程技术使CAR-T细胞释放IL-18以诱导急性炎症应答等方式也可以增加CAR-T细胞对实体瘤的疗效：体内实验中使用释放IL-18及同时释放IL-18和IL-12的CAR-T细胞处理胰腺癌模型小鼠，40天后小鼠的存活率没有明显差异（83.3%、66.7%）且远高于仅释放IL-12（50%）及不释放细胞因子（0%）的对照组（p < 0.05）[96]。除了释放细胞因子外，通过基因工程使CAR-T细胞表达免疫检查点阻断蛋白同样可以增加CAR-T细胞疗法对肿瘤的抑制作用。据报道，IL-15、IL-7预处理CAR-T细胞可以阻断免疫检查点，使用IL-15、IL-7预处理的HER2-CAR-T细胞在治疗结肠癌及髓样乳腺癌模型小鼠中，10天后其肿瘤大小大约为25mm2及60 mm2，而使用IL-2、IL-7预处理的对照组大小约为60 mm2及90 mm2，表现出明显的疗效差异性（p<0.0001，p<0.05）[97]。靶向B7-H3的CAR-T细胞中共表达程序性死亡受体1（programmed cell death protein 1，PD-1）诱饵剂受体以阻断PD-1/PD-L1信号传导，从而增加CAR-T细胞在小鼠模型上的抗肿瘤效果：肺癌及卵巢癌模型小鼠使用表达PD-1阻滞蛋白的CAR-T细胞治疗后，小鼠肿瘤大小几乎没有增加而使用CAR-T细胞的对照组小鼠肿瘤直径增加约5-6倍（p<0.0001），揭示了在包括卵巢癌及肺巨细胞癌在内多种实体瘤的治疗中可能发挥重要作用[98]。Zou F等人通过基因工程将PD-1、T 淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白 3（T cell immunoglobulin domain and mucin domain 3，Tim-3）、淋巴细胞激活基因3（lymphocyte activating gene 3，Lag-3）三个免疫检查点受体拮抗剂引入CAR-T细胞（PTL-CAR-T细胞）中，增加了CD56的表达从而增强了其分泌IFN-γ和抑制CAR-T细胞凋亡的能力。在体内实验中PTL-CAR-T细胞用于治疗人类卵巢癌模型小鼠，在第80天时小鼠的存活率为87.5%，其存活率远高于仅表达PD-1或表达PD-1及Lag-3拮抗蛋白的存活率（37.5%）（p<0.0001）,表现出了出色抗肿瘤的效能[99]。
5.3 CAR-T细胞在实体瘤中的安全性问题
肿瘤相关抗原在正常组织中的低水平表达是造成CAR-T细胞靶向非肿瘤细胞导致正常组织损伤甚至危及生命的重要原因之一（即使是B淋巴细胞白血病的CAR-T细胞疗法有“万金油”靶点CD19蛋白，其在杀灭肿瘤细胞的同时，CD19阳性的正常B细胞也被清除[100]），因此对于实体瘤的治疗筛选出合适的抗原依旧是目前研究的热门[101]。减少CAR-T细胞脱靶毒性的主要思路是加强靶蛋白的特异性，因此抑制型CAR-T细胞的概念便被提出[102]。抑制型CAR-T（inhibitory CAR-T, iCAR-T）细胞将传统CAR-T细胞的胞内结构信号转导区域替换成PD-1或者是细胞毒T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4），在与正常组织中特定的靶点结合时可发挥抑制CAR-T细胞活化及应答的作用，从而确保CAR-T细胞的激活仅发生在肿瘤细胞上。Sadelain M及共事者的体内及体外实验表明：基于PD-1及CTLA-4的iCAR在非靶向的正常细胞中细胞因子的分泌抑制率分别为71-89%及48-67%；并且在B细胞白血病模型小鼠中使用基于PD-1的iCAR-T细胞治疗，靶向肿瘤细胞组小鼠仅为非靶向肿瘤细胞组及未治疗组小鼠肿瘤的体内成像荧光强度的1/3（p<0.001），可知使用iCAR可减少小鼠的脱靶毒性[103]。除此之外，自杀基因也可以消除T细胞并抑制其作用，其中诱导型半胱天冬酶9（iC9）就是CAR-T细胞的安全开关。iC9在使用二聚诱导剂（chemical inducer of dimerization,CID）后会产生二聚从而导致细胞的凋亡，Diaconu I等人研究证明含有iC9安全开关的CD19-CAR-T细胞的增殖及毒性被严格调控，体内实验中在使用CID后7天可见TNF-α、IL-6及IFN-γ的含量降低明显且肿瘤无复发倾向[104, 105]。
除了上述介绍的三类克服实体瘤中阻碍的常见方法外，最新的研究进展结合了以上数种CAR-T细胞作用模式及递药系统。Choe JH等人设计了synNotch（Synthetic Notch)系统用于胶质母细胞瘤的治疗。该系统可以特异性识别胶质母细胞瘤细胞表面特异性表达的EGFRvⅢ蛋白，从而激活靶向肝配蛋白A型受体2（ephrin type A receptor 2, EphA2）或IL13Rα2的CAR表达，以实现靶向激活迁移至肿瘤表面的CAR-T细胞，减少CAR-T细胞疗法的脱靶毒性。体内实验中，注射CAR-T细胞6天后使用免疫荧光成像可见synNotch-CAR T细胞仅在肿瘤部位表达EphA2或IL13Rα2抗体发挥杀伤作用。同时，相比于对照组，使用synNotch-CAR T细胞处理小鼠颅内肿瘤（EGFRvⅢ+）后肿瘤尺寸减小明显[106]。 Zhen Gu及其团队最新提出了“CAR-T细胞仓库”的术后缓释技术，将CAR-T细胞、抗PD-L1血小板及细胞因子IL-15装载于水凝胶中（CAR-T-P–aPDL1@gel）用于人黑色素瘤术后模型小鼠。体内试验显示相比于未处理组术后3周小鼠，CAR-T-P–aPDL1@gel实验组的复发病灶抑制明显，肿瘤荧光强度仅为空白对照组的1/60，实验组荧光成像见体内CAR-T细胞的含量增加，同时在原位肿瘤使用CAR-T-P–aPDL1@gel减少了对侧肿瘤的大小，提示CAR-T细胞被运输至远端肿瘤。为术后CAR-T细胞递药途径提供了思路[107]。
6. 总结与展望
CAR-T细胞疗法在治疗血液系统恶性肿瘤的不断进展和斐然成就为研究者提供了其在实体瘤治疗中的思路和信心，然而在实际的临床前及临床试验中，CAR-T细胞对于实体瘤的抗瘤效能及安全性都仍需更多改进。HNSCC作为世界常见的实体瘤之一，CAR-T细胞疗法在其治疗当中的运用仍然存在一些亟待攻克的难题：（1）缺乏合适的肿瘤特异性靶点：EGFR作为一个在90% HNSCC细胞上表达的抗原，其单克隆抗体西妥昔单抗被证明在肿瘤抑制方面发挥明显作用。然而由于EGFR在正常组织中的广泛表达，EGFR高亲和力的CAR-T细胞则会产生损伤胃肠道、呼吸系统及血液系统在内正常组织的脱靶毒性[108]。因此对于HNSCC的CAR-T细胞治疗中在选择作用靶点时不光要重视抗原的覆盖广度也要重视其特异性以减少对正常组织产生的脱靶毒性；（2）CRS是CAR-T细胞治疗常见的不良反应之一：患者可能产生发热、低血压、呼吸困难、血清中细胞因子数量增加等症状，严重时甚至导致死亡。有学者研究发现CAR-T细胞通过成孔蛋白E途径诱导肿瘤细胞发生焦亡，从而刺激巨噬细胞释放促炎细胞因子，和CRS的发生密切相关。因此，从理论上来说，将CAR-T细胞诱导HNSCC肿瘤细胞焦亡转变为细胞凋亡可以有效缓解CRS带来的不良后果[109]；（3）CAR-T细胞从血管向肿瘤病灶的渗透转移率较低及HNSCC肿瘤免疫抑制微环境对其活化的影响：改变CAR-T细胞的给药方式、结合其他治疗方式以及通过基因工程使CAR-T细胞释放细胞因子等方法都被证明对HNSCC病灶的物理、生化及生理屏障所产生的阻碍作用起削弱效果[76]；（4）CAR-T细胞的递药方式单一：虽然上文介绍了直接在肿瘤部位注射以及使用生物金属材料作为载体以增强CAR-T细胞在肿瘤部位的渗透作用，目前CAR-T细胞的常用使用方式是依旧是静脉注射。晚期HNSCC患者术后高达15-40%的复发率和远处转移是导致其死亡的主要原因，有学者提出有效的术后递药模式可以减少术后复发和转移风险，以提高患者生存质量，因此当前关于CAR-T细胞的研究也应该着眼于探索在手术部位使用CAR-T细胞治疗以减少HNSCC肿瘤细胞的术后残留及后续的复发转移[110, 111]。（5）体外合成CAR-T细胞产品耗费时间财力，Kymriah和Yescarta花费分别达到了惊人的47.3及37.3万美元且漫长的体外合成时间使患者及时获得治疗成为难题[16, 112]，同时在包括中国在内的多数癌症高发的发展中国家中目前还没有针对于CAR-T细胞产品的国家规范，高效及通用化合成CAR-T细胞的方法以及相关规范指导文件的出台也将是CAR-T细胞疗法在HNSCC的临床运用中必不可少的基础[113]。（6）除了上述的困难外，CAR-T细胞在HNSCC治疗中投入的人力物力远没有在其他实体瘤中丰富，也是造成CAR-T细胞疗法在HNSCC中进展较慢的原因之一。但是即使面临着严峻的研究环境，相信CAR-T细胞治疗会如同PD-1/PD-L1单抗免疫疗法在HNSCC治疗中的重要作用一样，在基因工程技术、药物递送技术以及免疫治疗的不断发展的基础下，将最终在HNSCC治疗中展现出更加蓬勃的生机，获得一席之地[114]。
表1.CAR-T细胞疗法在实体瘤中的运用
我表2. CAR-T细胞疗法在HNSCC中相关研究
表3.CAR-T细胞治疗副作用的解决措施
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